人铁转运蛋白的表达与纯化

作     者：贺庭慧 

作者单位：哈尔滨工业大学 

学位级别：硕士

导师姓名：李明晖

授予年度：2020年

学科分类：1001[医学-基础医学(可授医学、理学学位)] 10[医学] 

主      题：铁转运蛋白 SLC40A1 溶质转运蛋白 表达纯化 

摘      要：溶质转运蛋白（solute carriers,SLC）家族是人类基因组中第二大膜蛋白家族,也是最大的膜转运蛋白家族,并且广泛存在于原核生物和真核生物中。SLC家族蛋白位于细胞膜上,转运多种溶质,负责调节各种必须因子的摄入和排出,如氨基酸、无机离子、神经递质、激素、维生素和药物等,在多种细胞中发挥重要的功能。本论文的目的在于从若干种具有重要生理意义、有作为药物研发靶点潜力的SLC蛋白中,筛选出性质稳定、表达量高的蛋白,进行大量表达纯化,为后续通过结晶或者电镜的方式进行蛋白结构的研究提供基础。本论文首先通过荧光检测分子筛的方式通过初步筛选,该方式不需要蛋白大量表达以及纯化,只需要纳克级未纯化的蛋白就可以检测到。本论文从众多具有重要生理意义的SLC家族蛋白中筛选得到了十种表达量高、结构性质稳定的蛋白。从其中挑选了其中一种铁转运蛋白SLC40A1（FPN1）进行结构的初步探究。铁转运蛋白是目前已知的唯一调控铁转出的蛋白,参与了铁外排机制,是调节细胞内外铁平衡的非常关键的蛋白,在所有与铁输出的相关细胞中都有表达,SLC40A1基因突变也与某些遗传性疾病有关。本论文接下来进行了SLC40A1蛋白的大量表达、纯化和结构初步探究。首先通过表达系统优化在哺乳动物细胞以及昆虫细胞中进行表达,哺乳动物细胞又进行了悬浮和贴壁两种方式进行培养。本论文发现SLC40A1在昆虫细胞中表达量最高、结构性质稳定,后续在昆虫细胞中进行大量表达。通过昆虫细胞表达系统,表达得到目的蛋白,又通过去垢剂溶解、亲和层析、去除MBP标签以及分子筛层析等多个步骤,纯化得到了纯度较高、结构性质稳定的SLC40A1蛋白。接下来通过LCP结晶技术寻找合适的条件进行蛋白结晶,对结构进行初步探究,期望对后续蛋白结构和转运机制的研究提供一定的基础。研究SLC40A1蛋白的结构性质对于了解铁转出的作用机制以及相关疾病都有着十分重要的意义。