猪CD151蛋白和唾液酸对猪δ冠状病毒在细胞上增殖的影响研究

作     者：袁一心 

作者单位：河南农业大学 

学位级别：硕士

导师姓名：胡慧

授予年度：2020年

学科分类：090603[农学-临床兽医学] 09[农学] 0906[农学-兽医学] 

主      题：猪δ冠状病毒 CD151 唾液酸 

摘      要：近年来,多种感染人或动物的冠状病毒病的暴发给全世界带来了巨大的损失。研究发现冠状病毒具有高变异率,频繁跨种传播等特点,给防控带来很大难度。猪δ冠状病毒(Porcine deltacoronavirus,PDCoV)是以仔猪严重水样腹泻、脱水、呕吐等为临床特征的一种高度接触性肠道传染病,2014年首次在美国暴发后,迅速蔓延至多个养猪国家,给养猪界带来了巨大的经济损失。。目前对PDCoV的入侵受体以及入侵细胞机制尚不完全清楚。冠状病毒入侵细胞首先需要与宿主细胞进行结合,因此对PDCoV受体的研究有助于深入了解病毒的感染及跨种传播的机制,对新型抗病毒药物和特异性疫苗的研发及对冠状病毒感染的防控有重要意义。本实验室前期通过病毒蛋白铺覆试验发现PDCoV能够与宿主细胞膜中的CD151蛋白和唾液酸相互作用,但其是否为PDCoV的功能性受体则有待进一步研究。本试验对猪CD151在PDCoV感染过程中的作用进行了研究,证实转染并稳定表达CD151的293T不能被PDCoV感染,初步说明CD151不是PDCoV感染的功能性受体。同时对唾液酸在PDCoV感染宿主细胞中的作用进行了系统研究,发现破坏细胞表面糖类和细胞表面唾液酸后都会抑制PDCoV的感染。研究内容如下:1.猪CD151蛋白的体外过表达及其对PDCoV增殖影响的研究应用PCR扩增猪CD151蛋白基因,并将其连接在真核表达载体pEGFP-N1上,成功构建了重组载体pEGFP-N1-CD151,使用脂质体转染法将其转染至PDCoV非易感细胞293T中,通过荧光显微镜可见绿色荧光蛋白,应用western blot对转染后的细胞样品进行蛋白水平的检测,结果显示转染组细胞成功表达出CD151蛋白。用PDCoV感染瞬时表达CD151的293T细胞,通过PCR技术检测PDCoV的感染情况,结果显示转染并瞬时表达CD151的293T不能被PDCoV感染。2.细胞表面糖类对PDCoV增殖影响的研究为了确定细胞表面糖类在PDCoV感染宿主细胞时的作用,本试验先通过MTT试验对NaIO4溶液在ST细胞和LLC-PKI细胞上的安全浓度进行摸索,确定了 NaIO4溶液在两种细胞系上的安全浓度范围。确定安全浓度范围后选择0.2、1和5mM的NaIO4溶液对ST细胞和LLC-PK1细胞进行处理,然后进行接毒,24h后分别收集上清、细胞和混合液,通过RT-qPCR和TCID50测定样品中的病毒含量。结果显示随着NaIO4溶液浓度的升高,PDCoV含量也呈现下调趋势,表示随着NaIO4溶液浓度的升高,PDCoV在细胞上的增殖受到了抑制。进一步用间接免疫荧光法检测NaIO4溶液处理细胞前后的PDCoV的感染程度,结果显示在ST/LLC-PK1细胞中,使用NaIO4破坏细胞表面糖类后能明显降低PDCoV对细胞的感染性。3.细胞表面唾液酸对PDCoV增殖影响的研究为了进一步确定是细胞表面哪种糖类参与PDCoV感染宿主细胞的过程,本试验先通过MTT试验对神经氨酸酶溶液在ST细胞和LLC-PK1细胞上的安全浓度进行摸索,确定了神经氨酸酶溶液在两种细胞系上的安全浓度范围。选择0.0625、0.25、1和4U/ml的神经氨酸酶溶液对ST和LLC-PK1细胞进行处理,然后进行接毒,24h后分别收集上清、细胞和混合液。通过RT-qPCR和TCID50对细胞内和混合液样品中的病毒含量检测,结果显示随着神经氨酸酶浓度的升高,上清、细胞内和混合液样品的PDCoV含量呈现下降趋势,表示随着神经氨酸酶溶液浓度的升高,PDCoV对细胞的感染受到了抑制。间接免疫荧光法进行检测神经氨酸酶溶液处理细胞前后的PDCoV的感染程度,结果显示在ST/LLC-PK1细胞中,使用神经氨酸酶破坏细胞表面唾液酸后能明显降低PDCoV对细胞的感染。综上所述,CD151蛋白不能够介导PDCoV入侵宿主细胞;PDCoV在入侵阶段可能与细胞表面唾液酸结合使病毒粒子吸附在宿主细胞上。这些结果为PDCoV的受体研究提供了研究基础,也为PDCoV的抗病毒药物筛选提供一定的思路。