线粒体质量控制在多发性骨髓瘤硼替佐米耐药中的作用研究

作     者：丁盈盈 

作者单位：福建医科大学 

学位级别：硕士

导师姓名：陈君敏

授予年度：2019年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100214[医学-肿瘤学] 10[医学] 

主      题：多发性骨髓瘤 线粒体质量控制 硼替佐米耐药 Mdivi-1 3-MA 

摘      要：目的:证实线粒体质量控制参与多发性骨髓瘤（multiple myeloma,MM）细胞硼替佐米耐药,探讨使用线粒体分裂抑制剂（Mdivi-1）和自噬抑制剂（3-MA）干预逆转硼替佐米耐药的作用及其机制。方法:1.取冻存的RPMI 8226细胞体外培养,采用低浓度递增持续诱导法构建耐硼替佐米MM细胞株（命名为RPMI 8226BR）,CCK-8法检测硼替佐米对RPMI8226BR和RPMI 8226细胞的增殖抑制作用,计算IC 50值和耐药倍数;RT-PCR检测RPMI 8226BR和RPMI 8226细胞多药耐药基因（MDR）1的mRNA表达情况;荧光检测RPMI 8226BR和RPMI 8226细胞的线粒体活性氧（ROS）的产生情况;采用Western blot方法检测RPMI 8226BR和RPMI 8226细胞线粒体自噬相关蛋白（PINK1、Parkin）、线粒体动力学相关蛋白（Drp1、Mfn1）和自噬相关蛋白（LC3-II/LC3-I）的表达;用硼替佐米处理RPMI 8226BR和RPMI 8226细胞,Western blot检测其对凋亡相关蛋白（Bcl2、Bax）表达的影响。***-1和（或）3-MA联合硼替佐米对RPMI 8266BR细胞增殖及凋亡影响检测:不同浓度Mdivi-1或3-MA处理RPMI 8266BR细胞,CCK-8法检测硼替佐米对RPMI 8266BR细胞的增殖影响,计算Mdivi-1或3-MA的IC 50值,并用接近IC 50的浓度处理RPMI 8266BR细胞;将RPMI 8226BR细胞分为4组:不处理组、Mdivi-1、3-MA和Mdivi-1+3-MA组;荧光检测硼替佐米对各组线粒体ROS产生的影响;Western Blot方法检测硼替佐米对各组线粒体自噬相关蛋白（PINK1、Parkin）、线粒体动力学相关蛋白（Drp1、Mfn1）、自噬相关蛋白（LC3-II/LC3-I）和凋亡相关蛋白（Bcl2和Bax）的表达影响;流式分析硼替佐米对各组细胞凋亡的影响;。结果:1.采用了低浓度递增持续诱导法成功构建了RPMI 8226BR细胞。CCK-8法检测硼替佐米对RPMI 8226BR和RPMI 8226细胞作用24 h的增殖抑制作用,IC50分别为1.78μmol/L和0.07μmol/L,耐药倍数为25.4;作用48 h的IC 50,分别为0.81μmol/L和0.03μmol/L,耐药倍数为27;RT-PCR检测RPMI 8226BR和RPMI8226细胞的MDR1 mRNA的表达水平无明显差别;ROS检测显示RPMI 8226BR细胞线粒体ROS的产生较RPMI 8226细胞减少;Western blot结果显示RPMI8226BR细胞的Drp1、PINK1、Pakin、LC3-II/LC3-I的表达水平较RPMI 8226细胞增加,而Mfn1的表达水平两者比较无显著性差异;以硼替佐米处理RPMI8226BR和RPMI 8226细胞,显示硼替佐米处理后RPMI 8226细胞从图上看促凋亡蛋白Bax的表达有增高,而抗凋亡蛋白Bcl2的表达有降低,硼替佐米对RPMI8226BR细胞Bax和Bcl2蛋白的表达无明显影响。***-1或3-MA均能增加硼替佐米对RPMI 8226BR细胞的增殖抑制作用,且随药物浓度增大,抑制作用更加明显;ROS检测显示Mdivi-1组、3-MA组、Mdivi-1+3-MA组产生的ROS均高于不处理组。流式结果显示不处理组、Mdivi-1组、3-MA组、Mdivi-1+3-MA组的凋亡率分别为10.2%、16.2%、17.5%和24.9%;Western blot检测硼替佐米对各组线粒体自噬、线粒体动力学和凋亡相关蛋白表达的影响,结果显示Mdivi-1组、3-MA组、3-MA+Mdivi-1组的PINK1、Parkin、LC3-II/LC3-I、Mfn1、Bcl2的表达水平均低于不处理组,促凋亡蛋白Bax的表达均高于不处理组,而Drp 1在Mdivi-1组和3-MA+Mdivi-1组表达降低。结论:1.通过低浓度递增持续诱导法可成功构建RPMI 8226BR细胞。*** 8226细胞对硼替佐米耐药可能是通过增加线粒体分裂和线粒体自噬,清除受损的线粒体,从而减少线粒体ROS的产生,促进细胞存活。***-1和3-MA能逆转RPMI 8226细胞对硼替佐米的耐药性,联合用药的作用比单药更明显。***-1和3-MA逆转硼替佐米耐药的机制可能是分别抑制RPMI 8226BR细胞的线粒体分裂和自噬,增加RPMI 8226BR细胞线粒体ROS的产生,进而诱导细胞凋亡。