日本龟蜡蚧肠道微生物多样性分析及单宁降解菌筛选

作     者：郝文英 

作者单位：山西大学 

学位级别：硕士

导师姓名：张艳峰

授予年度：2020年

学科分类：07[理学] 0713[理学-生态学] 

主      题：日本龟蜡蚧 肠道微生物 多样性 营养代谢 单宁降解菌 

摘      要：日本龟蜡蚧Ceroplastes japonicus Green是一种种群聚集性植食性昆虫,以刺吸式口器吸食寄主植物韧皮部的汁液,但其寄主植物营养成分不足以满足日本龟蜡蚧生长所需,而肠道微生物能够为其补充缺失的营养,进而影响日本龟蜡蚧的生长发育。本研究通过高通量测序分析日本龟蜡蚧肠道微生物多样性,并对肠道微生物调控营养代谢及单宁降解进行了初步研究。主要研究结果如下:1.两种寄主植物上日本龟蜡蚧肠道微生物多样性选取枣树和柿树两种寄主植物上的日本龟蜡蚧成虫,对这两组样品肠道细菌16S rDNA可变区(V3+V4)进行高通量测序,分析两种寄主植物上日本龟蜡蚧肠道菌群的多样性和差异性。经过OTU分析,发现寄主为枣树上的日本龟蜡蚧肠道微生物约有1,290种,寄主为柿树上的日本龟蜡蚧肠道微生物约有1,306种,两者并无显著差异。厚壁菌门、变形菌门、拟杆菌门是日本龟蜡蚧肠道优势菌门。而厚壁菌门的梭菌纲、变形菌门的α-变形菌纲、拟杆菌门的拟杆菌纲在两组样品中占有主导地位。在目水平上,梭菌纲的梭菌目和拟杆菌纲的拟杆菌目占有绝对地位,其中拟杆菌目中丰富度最高的是拟杆菌科,梭菌目中丰富度最高的是韦荣氏球菌科。在属水平上,日本龟蜡蚧肠道微生物优势菌群主要是拟杆菌属、韦荣氏球菌属、乳杆菌属、噬甲基菌属、短波单胞菌属、毛螺菌属,但是在不同寄主上所占比例有所差异。寄生枣树上日本龟蜡蚧肠道优势菌属为拟杆菌属、韦荣氏球菌属、乳杆菌属分别占总比例的13.87%、7.54%和5.81%,略低于寄生在柿树上的日本龟蜡蚧肠道微生物所占比例(分别为15.71%、10.32%和6.24%),寄生在枣树上的日本龟蜡蚧肠道细菌噬甲基菌属(5.21%)和短波单胞菌属(5.05%)在肠道内的占比要显著高于柿树龟蜡蚧肠道微生物所占比例(分别为1.12%和1.38%)。2.同一寄主植物上日本龟蜡蚧和草履蚧肠道微生物差异性选取同一寄主植物柿树上寄生的日本龟蜡蚧和草履蚧,对这两组样品肠道微生物进行高通量测序分析,发现两种蚧虫肠道内的微生物从数量和种类上差异较大。经过OTU分析草履蚧肠道内微生物约有53种,而日本龟蜡蚧肠道微生物约有1,137种。在柿树上的日本龟蜡蚧肠道优势菌属为拟杆菌门中拟杆菌科的拟杆菌属、厚壁菌门中韦荣氏球菌科的韦荣氏球菌属、乳杆菌科的乳杆菌属、毛螺菌科的毛螺菌属和瘤胃菌科的粪杆菌属,占比分别为15.71%、10.32%、6.24%、3.88%和3.69%。而草履蚧肠道优势菌属主要是变形菌门中Anaplasmataceae的Wolbachia、肠杆菌科的Sodalis、拟杆菌门中Blattabacteriaceae的Candidatus-Uzinura,分别占到35.51%、29.08%和4.22%。3.日本龟蜡蚧肠道菌群变化对宿主营养代谢影响通过用复合抗生素处理,结合16S功能预测和日本龟蜡蚧血淋巴中营养成分的变化,分析肠道微生物对寄主营养代谢的影响。处理前后日本龟蜡蚧肠道优势菌群和代谢途径发生变化,处理组糖类代谢、核苷酸代谢和氨基酸代谢较对照组发生显著性变化。同时对寄主昆虫血淋巴葡萄糖、白蛋白、甘油三酯营养指标测定,对照组的葡萄糖、白蛋白、甘油三脂浓度显著地高于处理组,这与16S功能预测结果一致。表明抗生素处理后,合成营养物质的细菌减少,从而代谢发生紊乱。4.日本龟蜡蚧肠道内单宁降解菌的筛选通过分离培养,在日本龟蜡蚧肠道内筛选出三株降解单宁菌株,经过分子鉴定分别为蜡状芽孢杆菌Bacillus cereus、约翰逊不动杆菌Acinetobacter johnsonii XBB1、海泥芽孢杆菌Bacillus oceanisediminis 2691。同时对其进行单宁酶活性测定,在45℃,pH5.0的培养条件下,三株菌单宁酶活性逐渐上升,在第3天达到峰值。蜡状芽孢杆菌单宁酶性活峰值为14.33U/mL,约翰逊不动杆菌单宁酶性活峰值为22.33U/mL,海泥芽孢杆菌单宁酶性活峰值为15U/mL。本研究对日本龟蜡蚧的肠道微生物进行分析,获得了日本龟蜡蚧肠道的优势菌群和功能预测,探讨了菌群结构改变对寄主营养代谢影响,筛选出能够降解单宁的菌株,为进一步探讨日本龟蜡蚧肠道微生物的功能提供了理论基础,为防治害虫提供了新思路。