肠道外致病性大肠杆菌的耐药毒力相关分子特征

作     者：罗魁 

作者单位：郑州大学 

学位级别：硕士

导师姓名：杨海燕

授予年度：2020年

学科分类：100208[医学-临床检验诊断学] 1002[医学-临床医学] 10[医学] 

主      题：肠道外致病性大肠杆菌 抗生素耐药 PFGE分型 耐药基因 毒力基因 

摘      要：目的（1）分析ExPEC的背景信息,对ExPEC菌株进行PFGE分型,了解肠道外致病性大肠杆菌的流行病学特征和临床菌株的优势克隆群。（2）进行抗菌素敏感性实验,分析ExPEC的耐药情况,比较分析不同克隆群菌株的耐药表型差异。（3）优势克隆群ExPEC菌株测序,进行MLST分型。分析各PFGE克隆群的MLST型别以及不同MLST型和PFGE型ExPEC菌株的毒力和耐药基因携带情况。（4）分析菌株的测序信息,了解ExPEC不同克隆群之间的进化关系。方法（1）复苏保存在-80℃冰箱的菌株,筛选培养后挑取单菌落,用全自动快速生物质谱检测仪鉴定病原菌种属。（2）培养经鉴定的大肠杆菌,进行脉冲场凝胶电泳（PFGE）,获得的图像使用bionumeric软件处理,分析获得菌株分型结果。（3）根据PFGE分型的结果,选择优势克隆群菌株进行全基因组测序和组装,参考（GNX2F药敏板）抗生素敏感性实验说明书进行药敏实验。（4）在 Center for Genomic Epidemiology、VFDB 和 CARD 数据库中比对检测已测序大肠杆菌的耐药、毒力基因。（5）使用MUMmer（V3.23）软件,将组装好的基因组比对到参考基因组获得SNP（单核苷酸多态性）标记,使用FastTree（V2.1.11）软件绘制进化树并进行可视化。（6）运用统计分析软件SPSS 22.0对ExPEC耐药数据、毒力和耐药基因携带情况进行分析。结果（1）经鉴定761株样本菌株属大肠杆菌。将大肠杆菌进行PFGE分型,分析获得7个主要克隆群共324株菌株。（2）七个主要克隆群共324株菌株进行药敏试验,其中耐药率较高的是SXT（67.08%）、CIP（58.77%）、LVX（57.23%）、DOX（52.31%）和 FOT（51.38%）,碳青霉烯类药物 DOR（4.31%）、DOR（1.54%）、MEM（1.23%）和 IMI（0.62%）,有五株ExPEC对POL和COL耐药,只有TGC耐药率为零。有214株菌同时对三类及以上的抗生素耐药,多耐药率为66.05%。（3）七个克隆群中除Cluster 1外Cluster 2至Cluster 7分别主要属于CC69、CC95、CC14、CC10、CC131和CC38。各克隆群的多耐药率如下:Cluster 1:40.74%;Cluster 2:64.91%;Cluster 3:20.59%;Cluster 4:64.62%;Cluster 5:72.73%;Cluster 6:86.89%;Cluster 7:88.89%。（4）324株菌株分别属于6个进化枝,CC14和CC131是最大ExPEC的流行克隆群,ampC等耐药基因携带率高达94.14%。大量的毒力因子如摄铁因子entA的携带率为91.04%,allR的携带率为90.12%,侵袭因子ompA、aslA分别达到41.36%和80.86%,除两株菌株未发生gyrA突变,所有的ST1193菌株均出现喹诺酮耐药相关的gyrA、gyrB、parC和parE基因点突变。结论（1）大肠杆菌是感染性疾病的重要病原体,除去新生儿患者本研究ExPEC感染人群主要集中在40到90岁的中老年人。（2）本研究收集的菌株主要有七个流行克隆群,其中包含世界各地都有流行的大流行克隆群ST131,其多耐药特征显著,不同克隆群的耐药特征差异较大,新的流行克隆群ST1193或将成为下一个常见的多耐药克隆群,ST95作为人畜共患大肠杆菌病的重要致病原,是食品安全和人类健康的重大威胁。（3）ExPEC菌株严重的多耐药问题值得引起注意,特别是一些泛耐药株的出现以及耐粘菌素菌株的流行,ExPEC广泛携带抵抗人体免疫系统清除的毒力因子,这些毒力因子在肠道环境的传播将严重威胁人类健康。