BMP-4修饰BMSCs复合同种异体骨软骨柱修复兔膝关节软骨缺损

作     者：张飞 

作者单位：蚌埠医学院 

学位级别：硕士

导师姓名：郑和平

授予年度：2020年

学科分类：1002[医学-临床医学] 1001[医学-基础医学(可授医学、理学学位)] 10[医学] 

主      题：骨髓间充质干细胞 表面分子标志物 诱导分化 MOI BMP-4 COLⅡ Sox9 同种异体骨 HE 番红固绿 Masson 免疫组化 

摘      要：第一章BMSCs体外培养及鉴定目的:建立体外培养、鉴定BMSCs完整体系,为动物体内实验提供细胞来源。方法:1.取普通级雄性新西兰兔股骨及胫骨,全骨髓贴壁法分离原代BMSCs。2.倒置相差显微镜观察细胞形态变化,流式细胞仪检测CD34、CD45、CD29、CD44、CD90表面分子标志物表达率。3.对分离培养细胞进行成骨、脂肪及软骨诱导分化,诱导周期结束后行特异性染色（茜素红、油红O、阿利辛蓝染色）。结果:本实验分离、培养的原代细胞形态均一,呈长梭形,漩涡状、稻穗样分布。高表达CD29、CD44及CD90,低表达CD34、CD45。三系诱导可见脂滴、骨盐、胶原纤维形成,证实所培养细胞为BMSCs。第二章BMP-4对BMSCs体外增殖及成软骨分化影响目的:探明Ad-BMP-4对BMSCs体外增殖及相关成软骨蛋白分泌的影响。方法:1.取P2代细胞,设立病毒梯度组,感染细胞,观察绿色荧光蛋白表达情况,检测绿色荧光蛋白表达量以确定最佳MOI。2.取P2代细胞,设立对照组、空载组、实验组,于铺板第0d、1d、3d、5d、7d行CCK-8法检测细胞增殖。3.取P2代细胞,设立对照组、空载组、实验组,于铺板第0d、1d、3d、5d、7d裂解细胞,提取蛋白,ELISA检测BMSCs成软骨分化中相关蛋白分泌。4.取第3步所制蛋白样本,经加样、电泳、转膜、封闭、加抗体、洗涤、曝光取得蛋白条带。结果:MOI为100时,重组腺病毒载体感染效率高,细胞状态好。BMP-4能显著促进细胞体外增殖及成软骨相关蛋白Sox9、COLⅡ的分泌。第三章Ad-BMP-4-BMSCs复合同种异体骨软骨柱修复兔膝关节软骨缺损目的:以同种异体骨软骨柱作为生物支架,BMSCs作为种子细胞,BMP-4作为生物活性因子修复兔膝关节软骨缺损。方法:1.18只新西兰白兔无菌条件下取股骨髁关节面骨软骨柱36个,梯度降温。2.将同种异体骨软骨柱浸入细胞悬液,低速离心以充分吸附BMSCs。3.取24只新西兰兔,随机分4组,建立动物模型,按分组条件行对应处理。4.术后4w、8w、16w,各组分别取2只（4膝）动物标本,行HE染色、番红固绿染色、Masson染色及Ⅱ型胶原免疫组化检测。结果:D组16w时HE染色提示软骨缺损基本修复,新生组织与周围软骨整合度较高,层次清晰,无赘生现象;番红固绿及Masson染色可见周围有大量新生软骨组织;免疫组化显示Ⅱ型胶原蛋白呈强表达。