携肠球菌抗原的铁纳米颗粒制备及其免疫原性研究

作     者：和春昊 

作者单位：河南农业大学 

学位级别：硕士

导师姓名：陈丽颖

授予年度：2018年

学科分类：090602[农学-预防兽医学] 09[农学] 0906[农学-兽医学] 

主      题：粪肠球菌 铁蛋白 胶原蛋白黏附素 免疫原性 ELISA 

摘      要：肠球菌是条件性致病菌,由于耐药基因以及致病性在各种生物之间质粒转移,导致各种生物例如人、猪等哺乳动物感染肠球菌的机率增加,肠球菌的治疗和预防愈加困难。在肠球菌的感染中定植是关键的步骤,胶原蛋白黏附素ace能够促进肠球菌的黏附定植,损伤机体。因此,研究胶原蛋白黏附素的抗原表位疫苗成为预防和治疗肠球菌的关键。但是由于表位疫苗的免疫原性一般比较低,需要疫苗佐剂的添加来增强免疫原性,提高抗体水平。铁蛋白不仅能作为疫苗佐剂还能作为抗原递呈系统发挥作用。铁蛋白在不同的p H值下,亚基能够自动的组装和解体,可以利用蛋白亚基的表面连接抗原,提高抗原的特异性抗体水平。试验一为了制备铁蛋白纳米笼,首先解剖本课题组饲养的健康猪,对新鲜心脏通过TRIzol法提取总RNA,通过反转录试剂盒将RNA逆转录成c DNA,运用Primer 5.0对猪源铁蛋白亚基基因序列设计一对特异性引物,扩增出H亚基（546bp）,将H亚基与PMD18-T载体连接、转化,提质粒,测序正确后,与原核表达载体p ET-32a连接,大量表达蛋白,成功诱导出与预期的目的蛋白分子量相符的蛋白。铁蛋白亚基为可溶性蛋白,利用镍柱纯化蛋白,SDS-PAGE和Western Blot证明铁蛋白亚基具有良好的免疫原性,超滤浓缩蛋白,制备样品,透射电子显微镜成像观察铁蛋白的表征。结果表明铁蛋白亚基在生理条件下能够自组装成为纳米笼,并且具有中空结构,与天然的铁蛋白类似。我们可以得出这样的结论:缺铁核铁蛋白能够通过原核表达制备,操作简单,产量高。为铁蛋白作为疫苗佐剂和载体的打下基础。试验二为了制备携带抗原表位的铁蛋白纳米笼,首先利用生物信息学技术对胶原蛋白黏附素的氨基酸序列进行抗原表位预测,将预测的六条抗原表位基因序列合成在原核表达载体p ET-32a,命名为p ET-32a-ace1、p ET-32a-ace2、p ET-32a-ace3、p ET-32a-ace4、p ET-32a-ace5、p ET-32a-ace6,以及实验室保存的重组质粒p ET-32a-ace,设计一对新的特异性引物,扩增铁蛋白H亚基,将目的基因插入原核表达载体,转化、提质粒、测序成功后,表达融合蛋白,制备样品,透射电子显微镜下观察融合蛋白的表征,结果是p ET-32a-ace1-H、p ET-32a-ace3-H、p ET-32a-ace5-H、p ET-32a-ace6-H、p ET-32a-ace-H这五个融合蛋白为可溶性蛋白,p ET-32a-ace2-H、p ET-32a-ace4-H均为包涵体,由于蛋白本身的特性问题,只做可溶性蛋白,对五种蛋白SDS-PAGE和Western Blot,结果表明蛋白均有较强的免疫原性,电镜结果:p ET-32a-ace1-H、p ET-32a-ace3-H、p ET-32a-ace5-H、p ET-32a-ace6-H的表征是铁蛋白纳米笼,具有中空结构,直径与天然铁蛋白类似;p ET-32a-ace-H同样能形成蛋白纳米笼,但是没有中空结构,纳米笼的直径比天然铁蛋白大很多。我们可以知道铁蛋白与抗原表位连接之后,仍然能够自组装成为铁蛋白,但是由于抗原序列的长度不同,导致纳米笼的结构不同。p ET-32a-ace-H由于抗原序列大于H亚基序列,导致某些抗原蛋白被包裹在中空结构中,透射电镜观察不到中空结构。五个携带抗原表位的铁蛋白纳米笼的制备为下一步的动物实验提供了疫苗。试验三通过间接ELISA方法测定家兔的特异性抗体水平。首先大量制备实验二的各抗原表位疫苗,免疫家兔,同时设立对照组家兔,用普通的胶原蛋白黏附素免疫,耳缘静脉每周采血,ELISA测抗体效价,达到后心脏采血,分离血清,根据ELISA结果,可以知道六个蛋白的免疫原性趋势为:p ET-32a-ace5-Hp ET-32a-ace-Hp ET-32a-acep ET-32a-ace6-Hp ET-32a-ace3-Hp ET-32a-ace1-H。p ET-32a-ace5-H、p ET-32a-ace-H的抗体水平均显著高于p ET-32a-ace对照组;p ET-32a-ace6-H的抗体水平与对照组的抗体水平相当;p ET-32a-ace3-H、p ET-32a-ace1-H的抗体水平均低于p ET-32a-ace对照组,因此得出结论,铁蛋白能够明显增强抗原的免疫原性,提高抗体的免疫水平,最佳的抗原表位疫苗的是p ET-32a-ace5-H。综上所述,带抗原表位的铁蛋白纳米笼能引起高水平以及快速的免疫应答,铁蛋白作为载体以及佐剂,能够明显的增强表位蛋白的免疫原性,为研制粪肠球菌表位疫苗提供了理论基础和试验依据。