鲸类MLN和MLNR的适应性进化及蛋白功能分析

作     者：武云娥 

作者单位：南京师范大学 

学位级别：硕士

导师姓名：邓成

授予年度：2018年

学科分类：07[理学] 0713[理学-生态学] 

主      题：鲸类 MLN MLNR 适应性进化 正选择 鲸脂 假基因 

摘      要：鲸类(Cetaceas)是一类在进化上具有十分重要意义的次生性水生哺乳动物,距今约55-53百万年前其祖先由陆地进入海洋,伴随着形态的巨大改变以及快速适应辐射,逐渐演变成海洋哺乳动物中的优势物种。鲸类由陆地进入海洋的过程中,能量储存和保持体温是面临的重要的挑战,为了应对这种极端坏境,鲸类形成了厚厚的鲸脂层。本研究主要针对鲸类胃动素受体(motilin receptor,MLNR)和其配体胃动素(motilin,MLN)的适应性进化过程以及功能进行实验研究。MLN是一种由十二指肠黏膜的Mo细胞分泌的消化道激素,是胃肠蠕动的重要内分泌调节因子,参与形成小肠第三阶段的周期性移行性复合体,在哺乳动物的消化过程中发挥着重要的作用。遗传学研究表明,MLNR在小鼠等啮齿类动物中缺失,MLN也在部分啮齿类动物中以假基因的形式存在,仅在奥氏更格卢鼠中存在完整的、有潜在生物功能的、保守的ORF序列。聚合酶链式反应(PCR)技术扩增出12种鲸类MLNR基因以及16种鲸类MLN基因的完整ORF序列,发现除了弓头鲸外,其他11种鲸类的MLNR基因提前终止,以假基因的形式存在;4种鲸类的MLN基因提前终止。通过ClustalX和MEGA6软件对序列进行分析,选择牛的MLNR作为对照,分析导致提前终止的插入、缺失或点突变,将各MLNR假基因的第一个提前终止的密码子标注到蛋白的二级结构上,发现这些突变均导致蛋白二级结构的缩短,从而使其功能丧失。鲸类物种中,只有弓头鲸是唯一一个保存完整的MLNR-MLN受体-配体对的物种,而虎鲸等11种鲸类的MLNR变成假基因,只保存完整的MLN。为了进一步了解上述不同鲸类对MLNR和MLN保留情况的差异是否与水生环境相适应,即鲸类现存的MLNR和MLN基因的适应性进化过程,我们使用PAML和Datamonkey分析软件对MLNR和MLN进行选择压力分析,结果表明,MLNR和MLN基因在鲸类中受到正选择作用,提示二者在鲸类进化过程中发生了适应性进化。根据文献报道以及选择压力分析结果,我们猜测MLN可以促进鲸类脂肪的堆积,可能与鲸脂层的厚度有关。通过3T3-L1前脂肪细胞的诱导实验检测脂滴的形成、脂肪细胞分化marker基因PPARγ(过氧化物酶体增殖激活受体)的表达量以及成熟脂肪细胞对脂肪酸的摄取,证明化学合成的虎鲸MLN蛋白确实可以促进3T3-L1前脂肪细胞诱导分化为成熟脂肪细胞,PPARγ表达量增多,并能够促进成熟脂肪细胞对脂肪酸的摄取过程。有意思的是,在脂肪酸摄取实验中,虎鲸的MLN蛋白的作用效果比牛及人的MLN蛋白更加明显,说明MLN的功能在鲸类中发生了适应性进化,从而为其适应水生环境提供保障。由于鲸类物种中,只有弓头鲸是唯一一个保存完整的MLNR-MLN受体-配体对的,通过Ca检测法验证了弓头鲸的MLN和MLNR确实保留着完整的功能,根据演化生物学分析,我们猜测MLNR在弓头鲸中出现了新的功能。