甘草酸调控HMGB1介导自噬改善阿霉素心脏毒性的机制研究

作     者：吕雪丽 

作者单位：南方医科大学 

学位级别：硕士

导师姓名：李国锋

授予年度：2020年

学科分类：1006[医学-中西医结合] 10[医学] 100602[医学-中西医结合临床] 

主      题：HMGB1 甘草酸 自噬 阿霉素 心脏毒性 

摘      要：背景与目的阿霉素属蒽环类广谱抗肿瘤药物,但其心脏毒性限制了临床应用且机制尚未完全阐明。自噬是细胞内错误折叠蛋白质和受损细胞器降解的一个重要方式,具有正向和反向双重作用。研究表明阿霉素能造成自噬紊乱,而高迁移族蛋白B1(High-mobilitygroupbox 1,HMGB1)在细胞自噬中扮演重要角色。甘草酸是一种天然小分子化合物,能直接与HMGB1结合产生抑制作用。因此,本研究拟评价甘草酸能否缓解阿霉素的心脏毒性,并从自噬角度探索其是否通过调控HMGB1实现保护作用的分子机制。方法与结果MTT法研究甘草酸和阿霉素对H9c2心肌细胞体外增殖的影响,阿霉素(0-10 μM)能浓度依赖性地降低H9c2的细胞活力而甘草酸在0.8 mM以下对其无明显细胞毒性,且0.8 mM甘草酸干预12 h能明显提升H9c2细胞活力。此外,甘草酸能降低阿霉素刺激引发的H9c2氧化应激水平升高。采用JC-1法测定H9c2线粒体膜电位(Mitochondrial membranepotential,MMP)变化,甘草酸能显著回调阿霉素引起的MMP去极化。应用单次腹腔注射20mg/kg阿霉素建立Sprague-Dawley大鼠急性心脏毒性模型,甘草酸低(25 mg/kg)、高(50mg/kg)剂量治疗组均显著回调阿霉素引起的血浆谷草转氨酶(Aspartate aminotransferase,AST),肌酸激酶同工酶(Creatine Kinase,MB Form,CK-MB)和超氧化物歧化酶(Superoxidedismutase,SOD)酶活力异常变化。以上结果表明甘草酸能在体内外水平上减轻阿霉素引起的心脏毒性。阿霉素刺激下H9c2心肌细胞和原代乳鼠心肌细胞自噬标志物LC3 Ⅱ和选择性自噬受体p62均显著上调,提示阿霉素能够诱发心肌细胞自噬功能障碍,而甘草酸干预下能有效降低这一损害。体内结果同样显示甘草酸干预能够缓解自噬紊乱。此外,本研究采用自噬抑制剂巴佛洛霉素A1(Bafilomycin A1,BafA1(50 nM,2 h))和mCherry-GFP-LC3B腺病毒双荧光报告系统监测自噬流,发现阿霉素能够抑制自噬流下游自噬体降解,造成自噬流阻滞,而甘草酸预处理能有效疏通受阻的自噬流。Western blot检测阿霉素和甘草酸对Akt/mTOR信号通路的影响,结果显示在阿霉素刺激下,甘草酸干预能够明显下调其通路表达;采用小分子RNA干扰技术(RNAi)沉默HMGB1能够显著提高H9c2细胞活力和抑制LC3 Ⅱ表达,表明HMGB1蛋白在阿霉素心肌损伤中占重要地位。另一方面,与阿霉素组相比,甘草酸预处理后p-Akt,p-mTOR和LC3 Ⅱ,p62的表达在H9c2/HMGB1-cells(transfected with HMGB1 siRNA)中无统计学差异,但在 non-silencing H9c2 cells(transfected with NC siRNA)中,甘草酸预处理能够显著下调其表达。提示甘草酸可能通过抑制HMGB1介导的Akt/mTOR自噬信号通路降低阿霉素的心脏毒性。结论本研究提示,HMGB1介导Akt/mTOR信号通路进而疏通阻滞的自噬流可能是甘草酸调控阿霉素心脏毒性的新机制。甘草酸有望开发为防治阿霉素心脏毒性的潜力药物。