KLD-12多肽/rhBMP-2纤维凝胶复合BMSCs后诱导横突间成骨活性的试验研究

作     者：王秉轩 

作者单位：石河子大学 

学位级别：硕士

导师姓名：孙建华

授予年度：2020年

学科分类：08[工学] 0805[工学-材料科学与工程（可授工学、理学学位）] 

主      题：KLD-12多肽 rhBMP-2 BMSCs 骨组织工程 

摘      要：目的:探讨KLD-12自组装多肽/重组人类骨形态发生蛋白-2(recombinant human bone morphogenetic protein 2,rhBMP-2)纤维凝胶复合骨髓间充质干细胞(BMSCs,Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells)在兔横突间隙处成骨效果。方法:(1)BMSCs的培养。BMSCs排列紧密,贴壁后细胞多数为梭形形态,3代BMSCs活性较高。BMSCs具有密度依赖性,较高的种植密度可能对细胞增殖效果有促进作用。(2)KLD-12多肽缓释实验。将rhBMP-2溶液以不同浓度稀释,并与KLD-12混匀。以1:1在混合液上方加入新的PBS缓冲液,每天更换并收集上清PBS液10天,并用Elisa法检测上清rhBMP-2含量。(3)复合KLD-12多肽BMSCs增殖实验。细胞计数试剂盒(cell counting kit-8)法检测与凝胶复合后BMSCs增殖活性。(4)动物实验。新西兰大白兔,随机等分入A组实验组、B组阳性对照组、C组阴性对照组、D组假手术组四组,每组10只,将实验材料植入横突间隙处。A组为实验组(KLD-12多肽/rhBMP-2/BMSCs);B组为阳性对照组(KLD-12多肽/rhBMP-2);C组为阴性对照组(KLD-12自组装多肽纤维凝胶);D组为假手术组(在横突间隙处创伤处理)。X线检测将在横突间隙处造模4、8、12周后进行,Micro-CT、大体测量观察、组织形态学检测只在横突间隙处造模12周后取材进行。结果:(1)KLD-12多肽缓释实验:KLD-12多肽具有缓释rhBMP-2的作用。(2)复合KLD-12多肽BMSCs增殖实验:BMSCs在KLD-12多肽中生长状态良好。(3)X线:四组在4周时均无明显成骨现象。A、B两组在横突间隙处造模后8周后均出现轻微的成骨现象,A组稍强于B组;C、D两组无明显成骨影像表现。A、B两组在横突间隙处造模12周后均有较为明显成骨区域,灰度差统计,A组成骨效应强于B组;C、D两组无明显成骨影像表现。(4)Micro-CT结果:12周时,A组的骨体积分数、骨小梁数量、骨小梁厚度、组织骨密度均大于B组阳性对照组。骨体积分数BV/TV(%):A组25.566±0.024、B组22.141±0.68;骨小梁数量TB.N(个/mm):A组7.239±0.56、B组5.996±0.35;组织骨密度TMD(mg/cm):A组523.363±10.53、B组412.366±3.733;骨小梁厚度Tb.Th(mm):A组0.165±0.022、B组0.103±0.009。Micro-CT各指标数据,A、B组差异有统计学意义(P0.05)。(5)大体标本观察:A、B两组在横突间隙处造模12周取材后钳夹硬度均较高,成骨取材组织面积A组均大于B组;C、D组未发现明显成骨组织。(6)HE染色:可见骨细胞(骨陷窝),成骨细胞与破骨细胞。(7)Giemsa染色:可见骨细胞与骨陷窝,以及骨小梁边缘处成、破骨细胞。结论:在横突间隙处KLD-12多肽/rhBMP-2/BMSCs纳米纤维凝胶种植后成骨良好,对于复合在KLD-12多肽之中的rhBMP-2可以缓慢释放。在KLD-12降低局部rhBMP-2的浓度的同时,因为BMSCs与rhBMP-2的协同作用,弥补了经KLD-12多肽缓释后rhBMP-2低浓度引起成骨效应缺失。