Hog1、Slt2-MAP激酶对梨果蜡质及疏水性诱导Alternaria alternata侵染结构分化的调控作用

作     者：王调兰 

作者单位：甘肃农业大学 

学位级别：硕士

导师姓名：李永才

授予年度：2020年

学科分类：1007[医学-药学(可授医学、理学学位)] 1006[医学-中西医结合] 100706[医学-药理学] 100602[医学-中西医结合临床] 10[医学] 

主      题：Alternaria alternata Hog1-MAPK Slt2-MAPK 基因敲除 功能验证 

摘      要：促分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)级联信号途径对病原真菌生长、形态建成、侵染结构分化、次生代谢、致病性及渗透胁迫响应等多种生理功能具有调节作用,其调控作用因病原物种类、互作系统而异。为进一步阐明Hog1与Slt2-MAP激酶是否参与及如何调控Alternaria alternata响应梨果表皮疏水性和蜡质信号从而启动侵染的过程,本试验在药理学试验的基础上,对梨果致病真菌***(JT-03)MAPK基因Hog1、Slt2进行鉴定、克隆和生物信息学分析,并构建缺失突变株和回复菌株,从分子水平上系统研究了Hog1和Slt2的生物学功能及对***响应梨果皮蜡质物化信号进而启动侵染的调控机制,结果如下:1.药理学结果表明MAPK特异性的抑制剂SB203580可显著地抑制梨果蜡质和疏水性诱导的***孢子萌发及附着胞的形成,同时也减弱了***对早酥梨的致病能力。2.对Hog1、Slt2-MAP激酶进行基因克隆后分别得到大小为1615bp和1747bp的克隆产物AaHog1和AaSlt2。同源序列比对得知AaHog1和AaSlt2基因编码产物均分别含有高渗反应所需的独特磷酸化基序“TGY和自我磷酸化位点“TEY。二级结构的主要元件是α-螺旋和无规卷曲,三级结构具有稳定的空间结构,均属于亲水性稳定蛋白。系统进化树表明AaHog1与AaSlt2基因分别与Alternaria longipes的Hog和Alternaria arborescens的Slt基因的同源性高达99%和91%。3.利用同源重组法构建ΔAaHog1,ΔAaSlt2,ΔAaHog1-C和ΔAaSlt2-C突变株。与野生型相比,ΔAaHog1和ΔAaSlt2的孢子形态和大小均发生了变化,菌落生长缓慢,产孢量分别显著降低了12.53%和68.13%(p0.05);ΔAaHog1和ΔAaSlt2在涂蜡表面和疏水表面孢子萌发、附着胞和侵染菌丝均显著低于野生型,其中ΔAaSlt2在洋葱表皮涂蜡表面的侵染结构分化显著受到抑制,培养8 h时,附着胞和侵染菌丝形成的相对抑制率高达67.76%和93.33%(p0.05)。4.ΔAaSlt2对细胞壁干扰剂(CR和SDS)和HO胁迫较为敏感,ΔAaHog1对各种外界胁迫(NaCl,sorbitol,CR,SDS及HO)均敏感。ΔAaHog1和ΔAaSlt2的细胞壁降解酶活性(PG,PMG,Cx和β-葡萄糖苷酶)、黑色素和ALT毒素的含量均显著低于野生型;同时发现ΔAaHog1和ΔAaSlt2损伤接种的早酥梨3 d后病斑直径抑制率分别为57.07%和57.48%(p0.05),并且梨果黑斑病并未随着贮藏时间的延长而扩展。综上,AaHog1与AaSlt2均对梨果黑斑病菌***孢子的形态、侵染结构、生长、细胞壁完整性和致病性等均具有调控作用。其中AaSlt2在参与***对梨果蜡质与疏水性的识别和响应过程中发挥更重要的作用。