类器官芯片在膀胱癌个体化治疗药物敏感性分析中的应用

作     者：熊巧 

作者单位：中国人民解放军海军军医大学 

学位级别：硕士

导师姓名：许传亮

授予年度：2020年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100214[医学-肿瘤学] 10[医学] 

主      题：膀胱癌 类器官芯片 个体化治疗 敏感性分析 临床应用 

摘      要：背景膀胱癌是最常见的泌尿系统肿瘤之一,临床上通常将膀胱癌分为肌层浸润型（muscle invasive bladder cancer,MIBC）和非肌层浸润型（non-muscle invasive bladder cancer,NMIBC）,其中非肌层浸润型膀胱癌占全部膀胱肿瘤的75%～85%。在手术方式上,肌层浸润型膀胱癌主要采取根治性膀胱全切术（RC）治疗,而非肌层浸润型膀胱癌则采用经尿道膀胱肿瘤切除术（TURBT）治疗,高级别膀胱癌在经尿道切除肿瘤后还需要进一步灌注化疗。近年来膀胱癌化疗的有效性一直是膀胱癌临床治疗的焦点问题,当前临床应用于膀胱癌化疗的药物有几十种之多,以顺铂为基础的化疗方案延用近30年无改变,近50%患者对该方案耐药,因此针对单个病人的膀胱癌个体化治疗具有重要意义。类器官是一种取材于人体组织并且通过模拟体内环境在体外培养而获得的可独立生长的离体组织,其通过模拟人体环境设置各种培养条件以得到最接近人体器官各项功能指标和理化性质的组织。类器官研究相对于目前研究中常用的细胞系实验和动物实验,具有更好的亲代相似性和个体化特征,在各种临床机制研究和药物筛选研究中具有更广泛的应用前景。近年来,随着高分子材料和微系统加工技术的进步,以PDMS微流控芯片为代表的微流控技术在生物医学中的应用价值逐渐得到重视。PDMS芯片具有较好的疏水透气性和生物相容性,能够通过微管道实现各种条件的精确控制,较好模拟人体各种微环境,为人体各种组织类器官的体外培养提供了合适的载体。虽然各种以微流控芯片为平台的人体组织类器官层出不穷,但是其功能结合并不紧密,相关芯片要么着眼于模拟人体微环境而用于细胞培养研究,要么着眼于芯片的精确控制功能而忽略了其临床应用价值,芯片的设计复杂效率低下不能短期应用于临床推广应用。本课题以临床应用为基准,通过对膀胱癌类器官芯片进行研究,构建了低价高效、高通量、简洁方便可广泛应用的膀胱癌类器官芯片（Organoids-on-a-chip）,并将其应用于膀胱癌临床化疗药物筛选,提高了药物治疗针对性。目的1、探索膀胱癌类器官的培养和检测技术。2、探索适合膀胱癌类器官生长的PDMS微流控芯片的设计加工工艺。3、膀胱癌类器官芯片构建流程及其在临床化疗药物筛选的应用。方法1、将在手术室取得的膀胱癌电切或全切标本进行标准化处理,获得具有遗传稳定性、可以长期存活的个体化膀胱癌类器官,通过免疫组化和染色体不稳定性测序对制备的类器官进行验证。2、利用流体力学和统计学原理,通过Auto CAD和SOLIDWORKS软件设计微流控芯片,将设计好的芯片用多物理场耦合分析软件COMSOL Multiphysics进行层流和浓度扩散场进行仿真分析,得到最佳的设计方案,将设计好的微流控模型通过光刻、浇筑、键合等步骤制作成完整的微流控芯片。3、将前期培养的膀胱癌类器官导入微流控芯片,通过对导入流程、培养环境和宏观结构的调整实现类器官芯片的高通量、长期正常生长,构建出具有临床应用价值的膀胱癌类器官芯片,并将类器官芯片应用于临床化疗药物筛选。结果1、经过对体外肿瘤组织处理流程、培养条件等进行优化,获得的膀胱癌类器官组织块,可以在体外长期培养,且经过病理染色和染色体测序验证,其具有较好的遗传稳定性和亲代相似性,可以用于个体化患者药物筛选。2、通过软件分别设计得到微流控芯片的二维和三维模型结构,再通过仿真结果对芯片进行多次修改和反复优化,最终获得了稳定的芯片模型,在芯片制备过程中克服脱胶和污染等技术难点,最终制备得到了合格稳定的微流控芯片。3、通过标准流程将膀胱癌组织类器官导入微流控芯片成功构建了类器官芯片,芯片中的类器官能够正常生长且呈现出不同特性,将类器官芯片初步应用于化疗药物筛选具有高效、低价、结果直观可靠等优点,能够较好应用于临床。结论本研究是一项临床应用与基础相结合的研究,前期分别对微流控芯片设计制作流程和膀胱癌类器官体外培养进行了研究,获得了可靠的芯片结构和成熟的体外类器官培养体系。其次将微流控芯片与膀胱癌类器官结合构建了高通量膀胱癌类器官芯片,将成熟的类器官芯片应用于化疗药物筛选,最后结果表明膀胱癌微流控类器官芯片在临床化疗药物筛选中具有方便简单、高效低价等优势,在临床上有较高的应用前景。