重组大肠杆菌全细胞催化制备5-甲基吡嗪-2-羧酸

作     者：顾刘燕 

作者单位：江南大学 

学位级别：硕士

导师姓名：刘龙

授予年度：2020年

学科分类：1007[医学-药学(可授医学、理学学位)] 10[医学] 

主      题：5-甲基吡嗪-2-羧酸 全细胞催化 CRISPR/Cas9 二甲苯单加氧酶 定点突变 

摘      要：5-甲基吡嗪-2-羧酸(5-Methylpyrazine-2-carboxylic acid,MPCA)是重要的医药中间体,被广泛应用于降血糖药物、降血脂药物及治疗结核病药物的合成。传统的化学合成法、现有的野生菌转化法及酶催化法合成MPCA存在着环境污染,生产周期长及需要利用有毒物质二甲苯等问题,因此本研究建立了一种对环境友好的重组大肠杆菌(Escherichia coli)全细胞催化高效制备MPCA的方法。首先,为了在***中构建MPCA的合成途径,克隆来源于恶臭假单胞杆菌(Pseudomonas putida)ATCC 33015编码二甲苯单加氧酶(Xylene monooxygenase,XMO)的xylM和xylA基因,编码苯甲醇脱氢酶(Benzyl alcohol dehydrogenase,BADH)的xylB基因和编码苯甲醛脱氢酶(Benzaldehyde dehydrogenase,BZDH)的xylC基因至表达载体pET28a。对菌体收集的时期、三个酶的表达量组合进行优化获得重组菌*** MABC1,并对其催化条件进行优化,确定最优条件为:细胞量OD=100,pH 8.0,温度20C,底物2,5-二甲基吡嗪(2,5-Dimethylpyrazine,DMP)浓度12 g·L,催化时间48 h,在这一过程中发现限制MPCA产量提高的关键酶为XMO。通过对XMO中编码电子转移蛋白的xylA基因前的RBS进行优化,获得一株正向菌株*** ARBS3,MPCA产量提高至10.2 g·L,MPCA对DMP的得率提高到0.665 mol/mol。其次,通过利用CRISPR/Cas9基因组编辑技术整合MPCA合成途径至基因组并调节xylM和xylA在基因组上拷贝数的比例,构建了无质粒高产MPCA菌株*** MPCA8,最终产量达到15.6 g?L,并且MPCA对DMP的得率达到1 mol/mol,同时所需细胞量降低为OD=75,催化时间缩短为36 h。最后,我们采用穿线法对XMO中起催化作用的受体羟化酶进行蛋白建模,利用软件Discovery Studio进行分子对接得到5个关键氨基酸位点。对这5个关键位点进行定点饱和突变后,获得催化活性提高的突变株L151F,其催化活性为67 mg·h·gDCW。对该突变株进行催化验证,MPCA产量达到11.6 g·L,与携带质粒的重组菌*** ARBS3相比有所提高。