三种红花提取物对脂多糖致急性肺损伤和中性粒细胞外诱捕网络形成的干预作用

作     者：王云鹏 

作者单位：中国人民解放军海军军医大学 

学位级别：硕士

导师姓名：邓小明

授予年度：2020年

学科分类：1006[医学-中西医结合] 10[医学] 100602[医学-中西医结合临床] 

主      题：红花黄色素A 羟基红花黄色素A 脱水红花黄色素B 脂多糖 急性肺损伤 中性粒细胞外诱捕网络 Raf MEK ERK 

摘      要：研究目的:急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory disease syndrome,ARDS)是临床上严重的呼吸系统疾病,常导致重症患者的死亡率增加。急性呼吸窘迫症可由多种因素引起,包括重症肺炎、烧伤、脓毒症等。其病理生理特点是肺泡毛细血管内皮细胞及上皮细胞受损、急性弥漫性炎症损伤、肺泡充血水肿及肺顺应性下降等。在2012柏林标准中,急性肺损伤(acute lung injury,ALI)的概念由轻度ARDS替代,但在动物模型中模拟ARDS的过程仍称为急性肺损伤。虽然目前有大量关于急性呼吸窘迫症的研究,但尚未发现治疗急性呼吸窘迫症的特效药物。血必净是目前我国治疗脓毒症和多器官功能障碍的中药新药,主要由五种中药材提取物组成,包括红花、丹参、当归、川芎、赤芍等。一项质谱检测对使用血必净的小鼠血清中的活性药物成分进行了分析,发现血必净主要成分中与红花相关的组分包括红花黄色素A(safflor yellow A,SYA),羟基红花黄色素A(hydroxysafflor yellow A,HSYA)和脱水红花黄色素B(anhydrosafflor yellow B,AHSYB)等,红花具有活血化瘀、改善微循环的效应,我们推测在急性肺损伤中红花对肺部炎症可能具有一定的干预作用。目前已有研究报道,红花黄色素A、羟基红花黄色素A可减轻急性肺损伤,但未见脱水红花黄色素B对脓毒症相关的肺损伤的影响的报道。本研究拟探究红花黄色素A,羟基红花黄色素A和脱水红花黄色素B三种红花成分对脂多糖(lipopolysaccharides,LPS)致急性肺损伤的干预作用,以及它们对中性粒细胞外诱捕网络释放及相关通路的影响。研究方法:在动物实验中,随机将8～12周龄,体重20g～25g的雄性C57BL/6小鼠分为5组:对照组,ALI组,ALI+SYA(5×10mol/kg)组,ALI+HSYA(5×10mol/kg)组,ALI+AHSYB(5×10mol/kg)组,通过气管内注射LPS(10mg/kg)构建小鼠急性肺损伤模型,同时腹腔分别注射生理盐水、SYA、HSYA、AHSYB 400μl。24小时后经眼球采血,离心后取上清测定炎症因子水平和MPO-DNA复合物含量;肺泡灌洗液测定总蛋白浓度,流式分析总细胞数与中性粒细胞比例;取肺组织测湿干比,组织病理染色与免疫荧光染色,裂解后行Western blot测定相关通路蛋白表达。细胞实验中,HL-60细胞培养于RMPI+10%胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)中,用二甲基亚砜[dimethyl sulfoxide,DMSO(终浓度1.25%)]诱导分化为中性粒细胞后,加入氟波酯[phorbolmyistste,PMA(100 ng/ml)]刺激细胞,同时分别予培养基、SYA、HSYA、AHSYB(160 mg/l)。3小时后取培养液上清离心后测定MPO-DNA复合物含量,细胞裂解后行Western blot测定相关蛋白表达。实验结果:1.LPS气管内注射24 h后,肺组织H&E染色病理切片显示与对照组相比,肺损伤组小鼠肺组织充血、水肿、肺间隔增厚或受损,并且肺泡及间质炎症细胞浸润明显;SYA组、HSYA组、AHSYB组小鼠的肺组织H&E染色切片显示肺组织损伤程度减轻。肺组织损伤病理评分也表明SYA组、HSYA组、AHSYB组病理评分显著低于肺损伤组,这说明SYA、HSYA、AHSYB可降低LPS气管内注射引起的肺组织损伤。2.LPS气管内注射24 h后,小鼠血浆及支气管肺泡灌洗液中TNF-α和IL-6浓度显著增加,而SYA、HSYA、AHSYB组小鼠血浆及支气管肺泡灌洗液中细胞因子TNF-a和IF-6浓度明显低于LPS组。3.LPS气管内注射24 h后,与对照组相比,ALI组小鼠肺组织湿/干比升高,HSYA、AHSYB可降低ALI小鼠的湿/干比,而SYA未见明显作用;小鼠支气管肺泡灌洗液蛋白含量在肺损伤组明显增加,而SYA、HSYA、AHSYB可减少小鼠支气管肺泡灌洗液的蛋白含量;肺损伤组小鼠肺泡灌洗液总细胞数、中性粒细胞比例与对照组相比显著增加,SYA、HSYA、AHSYB可一定程度减少中性粒细胞浸润。4.LPS处理24 h后,肺组织免疫荧光染色切片显示与对照组小鼠肺组织相比,ALI组小鼠肺组织中有更多MPO和组蛋白分泌。SYA、HSYA、AHSYB组小鼠肺组织与对照组相比MPO和组蛋白分泌增加,但与ALI组相比明显减少。5.在体实验中,LPS显著增加小鼠血浆中MPO-DNA复合物的水平,而SYA、HSYA、AHSYB组小鼠血浆中MPO-DNA复合物的含量明显低于ALI组;体外实验中,PMA刺激HL-60细胞后产生MPO-DNA复合物,SYA、HSYA、AHSYB处理可减少MPO-DNA复合物的形成。6.对照组小鼠肺组织Raf、MEK、ERK磷酸化水平较低,小鼠经气管内注射LPS后Raf、MEK、ERK磷酸化水平显著升高,而SYA、HSYA、AHSYB处理后Raf、MEK、ERK磷酸化水平明显下降;细胞经PMA刺激后Raf、MEK、ERK磷酸化水平显著升高,而SYA、HSYA、AHSYB处理后Raf、MEK、ERK磷酸化水平明显下降。结论:SYA、HSYA、AHSYB均可改善LPS诱导的小鼠急性肺损伤严重程度,可能与三者对中性粒细胞NETs形成与Raf/MEK/ERK通路的抑制有关,但其分子机制仍有待进一步研究。