几种病原菌感染短蛸的病理学研究及TLR13基因的克隆与表达

作     者：王金龙 

作者单位：上海海洋大学 

学位级别：硕士

导师姓名：冯艳微;徐晓辉

授予年度：2020年

学科分类：0908[农学-水产] 09[农学] 

主      题：短蛸 鳗弧菌 病理学 菌群结构 TLR13 

摘      要：短蛸（Octopus ocellatus）是我国北方沿海地区经济物种。近年来由于环境的不断恶化和短蛸的过度捕捞,导致短蛸的供应不足,开展短蛸的人工养殖迫在眉睫。短蛸养殖过程中由病原菌感染导致的细菌性疾病,给短蛸养殖业带来了不小的难题与挑战。本研究主要进行了短蛸感染鳗弧菌和副溶血弧菌后组织的病理学观察;通过16S扩增子技术检测了病原菌感染后短蛸肝脏的菌群结构分布及多样性变化;最后分析了TLR13基因在短蛸不同组织及鳗弧菌感染后不同时间点的表达规律,以期为短蛸的疾病防控和免疫识别分子应答机制研究提供理论基础。具体研究内容如下:（1）从组织病理学角度出发,对人工感染鳗弧菌和副溶血弧菌的短蛸进行了病理学观察和研究,组织切片结果发现短蛸的肝脏、鳃心、鳃以及白体皆有明显的病理学改变,肝细胞呈现许多空泡化,细胞膜分裂,肝锁支架的结构也变得不完整;鳃细胞除了明显的形态变化外,鳃小叶和上皮细胞微绒毛都有所破坏,这些都会影响鳃的呼吸、排泄等功能;白体内含有大量的造血干细胞、祖细胞及血细胞前体细胞和血细胞,白体也是身体很好的血液供应组织,经鳗弧菌和副溶血弧菌感染后的白体细胞除了出现明显的细胞空泡化外,还有一些细胞碎片和细胞皱缩的现象导致其造血功能降低;鳃心细胞出现核膜破裂、核仁解体的现象,导致了鳃心的清除细菌和解毒功能降低。（2）通过16S扩增子技术对鳗弧菌和爱德华氏菌感染后的短蛸肝脏菌群结构及多样性变化进行了研究。结果如下,由鳗弧菌感染短蛸肝脏的Shannon index爱德华氏菌感染组对照组,而鳗弧菌感染短蛸肝脏的Simpson指数爱德华氏菌感染组对照组,说明鳗弧菌和爱德华氏菌感染短蛸会导致群落多样性降低,爱德华氏菌感染组的群落多样性高于鳗弧菌感染组的群落多样性。通过稀疏性曲线和物种丰度聚类树可知,鳗弧菌感染组和对照组差异明显,爱德华氏菌感染组的菌群结构及多样性和对照组更为接近。以上研究结果表明鳗弧菌对短蛸肝脏的影响更大。（3）TLR13基因的c DNA序列全长为2608bp,其中包括201bp的5’非编码区（UTR）,343bp的3’UTR,2064bp的开放阅读框（ORF）,共编码668个氨基酸,预测其分子量为79.5KDa,理论等电点为8.83。经SMART预测氨基酸结构发现,该序列共包括一个信号肽和三个结构域。通过实时荧光定量PCR法检测了TLR13基因的m RNA在健康短蛸肝脏、鳃、白体、系统心脏、肌肉及血细胞等组织中都有表达,其中在血液的表达量最高,在肝脏中的表达量最低。鳗弧菌感染短蛸可引起TLR13的m RNA在肝脏中表达量上调,感染24 h后达到最高峰,是刺激前的6.97倍。TLR13的升高表明该基因可能参与抵抗外源病原菌入侵的免疫应答。综上所述,本文进行了短蛸经鳗弧菌和副溶血弧菌感染后的病理学观察,发现短蛸体内各组织均有明显的病理学变化;利用16S扩增子技术研究短蛸肝脏由鳗弧菌和爱德华氏菌感染后短蛸肝脏菌群结构变化,研究发现鳗弧菌对短蛸肝脏的影响较爱德华氏菌更为强烈;克隆了短蛸TLR13基因,检测了其在各组织的表达情况和鳗弧菌菌感染后不同时间点的表达规律,发现了鳗弧菌可诱导短蛸TLR13基因上调,表明短蛸TLR13作为一种模式识别受体,可以识别鳗弧菌。以上的研究结果有利于对今后短蛸养殖中的疾病防控和准确诊断以及免疫应答机制的研究具有重要意义。