增强巨噬细胞清除皮肤老化细胞的活性成分筛选及作用机制研究

作     者：祁均梅 

作者单位：温州大学 

学位级别：硕士

导师姓名：胡振林

授予年度：2020年

学科分类：1007[医学-药学(可授医学、理学学位)] 1006[医学-中西医结合] 100706[医学-药理学] 100602[医学-中西医结合临床] 10[医学] 

主      题：皮肤老化 老化细胞 巨噬细胞 老化监督功能 肌肽 

摘      要：老化皮肤细胞的堆积是皮肤衰老的重要病理基础,巨噬细胞等免疫细胞具有老化细胞监督功能,即能够识别并清除老化细胞,但随年龄增加,皮肤免疫细胞的老化监督功能下降,导致皮肤老化细胞不能被及时清除而不断堆积。因此增强巨噬细胞等免疫细胞的老化监督功能,可能是安全、有效的皮肤延衰策略。本课题通过建立巨噬细胞与老化皮肤细胞的共培养模型,筛选能够增强巨噬细胞老化监督功能的活性成分,并探讨活性成分的作用机制,为发展靶向清除老化细胞的皮肤延衰新策略提供科学依据。本研究分为以下3个部分:(1)建立了巨噬细胞与老化皮肤细胞共培养模型:使用THP-1衍生的巨噬细胞与叔丁基过氧化氢(t-BHP)诱导老化的Ha Ca T角质形成细胞和HFF-1成纤维细胞建立巨噬细胞与老化皮肤细胞共培养模型,以SPi DER-βgal进行老化细胞的特异性荧光染色,q PCR检测衰老相关分泌表型(SASP)因子的表达水平。通过摸索t-BHP诱导皮肤细胞发生老化的实验条件,确定了分别以250μM和300μM的t-BHP作用2 h作为诱导Ha Ca T细胞和HFF-1细胞老化的最适实验条件;通过比较巨噬细胞在不同效靶比时对共培养的老化皮肤细胞的清除作用,确定了效靶比为5:1的巨噬细胞与老化皮肤细胞共培养系统可作为巨噬细胞老化监督功能增强剂的筛选模型。(2)筛选具有增强巨噬细胞老化监督功能的活性成分:在巨噬细胞与老化皮肤细胞共培养模型及老化皮肤细胞单独培养模型上对比研究了多种候选成分对老化细胞的影响,发现积雪草提取物和肌肽能够增强巨噬细胞的老化监督功能,灵芝提取物、棕榈酰五肽-4、乙酰基六肽-8和六肽-3等虽然不能增强巨噬细胞老化监督功能,但具有直接清除老化皮肤细胞和抑制SASP因子表达的活性。(3)研究肌肽增强巨噬细胞老化监督功能的机制:荧光微球吞噬实验表明肌肽能促进巨噬细胞的吞噬功能;q PCR结果表明肌肽能够上调巨噬细胞吞噬受体CD36和RAGE的表达水平;以拮抗剂阻断CD36和RAGE受体之后,肌肽对巨噬细胞清除老化皮肤细胞的作用消失;Western blot检测结果表明肌肽能够激活AKT2信号通路,而阻断AKT2通路后肌肽上调巨噬细胞受体CD36、RAGE表达和清除老化皮肤细胞的作用消失。综上,本课题建立了巨噬细胞-老化皮肤细胞共培养和老化皮肤细胞单独培养模型,并在这两种模型上筛选发现肌肽能有效增强巨噬细胞的老化监督功能,其作用机制是通过活化巨噬细胞内的AKT2通路上调吞噬受体CD36和RAGE的表达,并提高巨噬细胞的吞噬功能,最终促进巨噬细胞对老化皮肤细胞的清除。