yRad52、Ad4 E1B55K和Ad4 E4orf6与Cas9共表达、融合表达对HDR效率的影响

作     者：房圆圆 

作者单位：西北农林科技大学 

学位级别：硕士

导师姓名：张智英

授予年度：2020年

学科分类：0710[理学-生物学] 07[理学] 08[工学] 0905[农学-畜牧学] 09[农学] 071007[理学-遗传学] 0901[农学-作物学] 0836[工学-生物工程] 090501[农学-动物遗传育种与繁殖] 090102[农学-作物遗传育种] 

主      题：CRISPR/Cas9系统 HDR Cas-Rad52融合表达 Cas9-T2A-E1B共表达 协同作用 

摘      要：CRISPR/Cas9系统作为新一代基因组编辑工具问世以来,引起了生命科学领域的狂潮,特别是在哺乳动物细胞中的应用。哺乳动物细胞通过多种途径修复双链断裂（Double strand break,DSB）,主要包括易错的非同源末端连接（Non-homologous end joining,NHEJ）和高保真的同源介导修复（Homology-directed repair,HDR）途径。通过CRISPR/Cas9成DSB后,主要通过NHEJ途径进行修复,这种途径易引入随机性的插入或缺失,是一种不精确的修复方式。在提供与目标基因座同源性的DNA模板的情况下,HDR途径则可以实现精确的基因组编辑。然而,HDR参与DSB修复的效率要远低于NHEJ。HDR的低效性仍然是精确基因组编辑技术的瓶颈,如何提高HDR效率成为研究者探索的热点。近年来,科学家们研究出多种策略来提高HDR效率,如抑制NHEJ通路、强化HDR通路、控制细胞周期等,均可在不同程度上提高HDR效率。本研究在相关研究的基础上,成功将酿酒酵母源Rad52（yRad52）、腺病毒4（Ad4）E4orf6和Ad4 E1B55K蛋白分别整合在CRISPR/Cas9系统中,比较了Cas9蛋白与重组蛋白yRad52、Ad4 E4orf6、Ad4 E1B55K蛋白共表达策略和融合表达策略对HDR效率的影响,期望为提高基因组精确编辑效率提供新的技术手段。本研究的主要结果如下:1.为了在报告载体水平上初步验证猜想,设计并构建了HDR效率检测荧光报告系统。将构建好的Cas9与yRad52蛋白、Ad4 E1B55K、Ad4 E4orf6蛋白共表达载体、融合表达载体分别与报告载体以及供体载体共转染至HEK293T细胞中,通过流式细胞仪分析荧光细胞数比较各组细胞HDR效率。对流式数据进行统计学分析,结果表明,在报告载体水平上,融合表达Cas9-Rad52能够使HDR效率显著增强约1.5倍,共表达Cas9-T2A-E4使HDR效率增强约1.4倍。2.在基因组水平进一步验证结论,将Cas9与yRad52蛋白、Ad4 E1B55K、Ad4E4orf6蛋白共表达载体、融合表达载体分别与HDR-USR1报告载体以及供体载体共转染HEK293T细胞,对EMX1位点进行点编辑,HDR-USR1是实验室新研发的通用筛选报告载体,可对HDR阳性细胞进行筛选富集。酶切结果灰度分析得出,融合表达Cas9-Rad52在HEK293T细胞基因组EMX1位点HDR效率为17.1±0.5%,较对照组增强约2倍;共表达Cas9-T2A-Rad52、Cas9-T2A-E1B的HDR效率为12.3±0.7%、12.1±0.7%,较对照组增强约1.4倍。3.将Cas9-Rad52融合表达载体与Ad4 E1B55K蛋白联合使用,灰度分析结果显示其HDR效率为16.3%,较对照组提高3.9倍,表明在HEK293T细胞EMX1位点,yRad52蛋白与Ad4 E1B55K蛋白具有协同作用,可进一步提高HDR精确编辑效率。总之,Cas9与yRad52的共表达、融合表达策略以及Cas9-T2A-E1B共表达策略均可以增强哺乳动物细胞基因组中的HDR效率,其中融合表达Cas9-Rad52增强效果最强。并且yRad52与Ad4 E1B55K蛋白的联合使用对促进HDR效率具有协同作用。本研究为提高HDR精确编辑效率提供了有效策略,有助于推动基因编辑在基础功能研究、精准医疗以及动物遗传育种方面的应用。