E3泛素连接酶复合体SCF-FBXO11在天然免疫应答中的调控作用及机制研究

作     者：夏思墨 

作者单位：中国人民解放军海军军医大学 

学位级别：硕士

导师姓名：徐胜

授予年度：2020年

学科分类：1001[医学-基础医学(可授医学、理学学位)] 100102[医学-免疫学] 10[医学] 

主      题：抗病毒天然免疫 泛素化 FBXO11 STING 

摘      要：天然免疫系统作为机体抵抗病原微生物的关键防线之一,主要是通过天然免疫细胞的模式识别受体（pattern-recognition receptor,PRR）识别病原微生物的病原体相关分子模式（pathogen associated molecular patterns,PAMPs）和自身来源的损伤相关分子模式（damage associated molecular patterns,DAMPs）。目前已知的天然免疫受体主要包括Toll样受体（Toll-likereceptors,TLRs）、RIG-I样受体（retinoid acid-inducible gene-I,RLRs）、NLR样受体（nucleotide binding oligomerization domain-like receptors,NLRs）、CLR样受体（C-type lectin receptors,CLRs）和DNA识别受体等。多种天然免疫识别受体识别释放到胞内的病原核酸（DNA和RNA）,其中参与识别DNA的受体主要包括TLR9、环鸟苷-腺苷二磷酸合成酶（cyclic guanosine monophosphate-adenosine monophosphate synthase,c GAS）、AIM2（absent in melanoma 2）和干扰素诱导蛋白16（inteferon inducible protein,IFI16）等。模式识别受体介导DNA识别后,激活天然免疫应答信号通路,最终诱导Ⅰ型干扰素（IFN）和促炎性细胞因子表达,杀伤并清除入侵的病原体。c GAS是目前研究最多的,也最被认可的细胞内DNA感受器,其调控的c GAS-STING信号通路是机体最经典的DNA应答途径。c GAS能结合各种形式的ds DNA,催化c GAMP的合成同时将信号向下游传递,c GAMP与位于内质网的干扰素诱导基因STING相互结合,促进STING形成二聚体转位到核周附近,活化的STING促进TBK1和IRF3的磷酸化,诱导Ⅰ型干扰素的转录和表达。在c GAS-STING信号通路中,STING作为接头蛋白发挥重要功能,有多种泛素连接酶或去泛素化酶调节STING的泛素化修饰,导致STING降解或影响其活性,进而调控下游信号通路蛋白的激活,维持机体的免疫平衡。泛素化是蛋白质功能调控的重要方式之一,受到E1泛素激活酶、E2泛素结合酶和E3泛素连接酶的泛素化酶系统与去泛素化酶（deubiquitinases,DUBs）系统拮抗调节。泛素化与去泛素化在蛋白质的功能调节中作用广泛且重要,在诸多的免疫过程中也扮演着重要角色。泛素是含有76个氨基酸的小分子多肽,单体分子量为8.6 k Da,通过与目的蛋白以共价键方式相连,从而调控它们的稳态或活性。泛素与底物的结合通常发生在赖氨酸残基上,由于泛素含有7个赖氨酸残基（K6、K11、K27、K29、K33、K48、K63）,因此产生7种不同类型的多聚泛素链,其中K63泛素化修饰和与蛋白酶体降解相关的K48泛素化修饰的研究最多。目前对于STING的泛素化调控已有一些报导仍有待进一步挖掘和完善。基于前期对STING信号通路的研究,我们通过IP-MS实验鉴定与STING相互作用的E3泛素连接酶,通过分析质谱数据,我们筛选了目前尚未报导的对STING有调控功能的E3泛素连接酶,发现了针对DNA病毒HSV-1具有显著调控功能的E3泛素连接酶复合体组分FBXO11。FBXO11是一种F-box家族蛋白,在调控细胞周期、肿瘤发生和转移发挥着重要作用,但在抗病毒免疫中的功能还没有研究。在本课题的研究中,我们首先明确了FBXO11在抗病毒天然免疫应答中的正向调控效应。在原代巨噬细胞中FBXO11的表达下调,显著抑制了DNA病毒HSV-1诱导下IFN-?、IFN-?4和炎性细胞因子的表达水平,而对RNA病毒VSV诱导的干扰素及炎症因子分泌未发现明显调控效应。双荧光素酶报告基因实验也发现FBXO11能有效增强c GAS-STING诱导的IFN-?荧光素酶报告基因水平的上调,而不能调控TBK1和IRF3以及RNA识别通路中RIG-I和MAVS诱导的IFN-?表达。因此,FBXO11选择性的调控DNA病毒诱导的抗病毒天然免疫应答。在机制研究中,通过Western Blot信号通路分析发现,FBXO11敲低后抑制了c GAS-STING通路中TBK1、IRF3和p65的磷酸化活化,提示FBXO11作用于STING或其上游。免疫共沉淀实验发现,FBXO11与STING相互作用。通过构建FBXO11和STING的截短体实验,证实了FBXO11与STING相互作用依赖于FBXO11的Pb H结构域和STING的C端结构域（C-terminal doma