长链非编码RNA LINC00909在脑胶质瘤中的作用与机制研究

作     者：柳振涛 

作者单位：中国人民解放军海军军医大学 

学位级别：硕士

导师姓名：胡国汉

授予年度：2020年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100214[医学-肿瘤学] 10[医学] 

主      题：胶质瘤 LINC00909 miR-194 MUC1 竞争性内源RNA 

摘      要：胶质瘤是中枢神经系统（CNS）最常见、侵袭性最高的原发性恶性肿瘤,具有复发率高、致死率高和治愈率低等特点,目前仍然是神经外科领域的一项重大挑战。尽管近年来在外科手术、放疗、化疗、分子靶向治疗及肿瘤电场治疗（TTFields）等方面都取得了一定的进展,但是胶质瘤患者的总体预后仍不理想。尤其是胶质母细胞瘤患者,中位生存期仅约14个月。胶质瘤的发病机制不清给患者的诊疗带来了巨大的障碍。因此,深入探索胶质瘤发生、发展的分子生物学机制,寻找特异性的治疗靶点成为当今神经外科领域研究的焦点。长链非编码RNA（lnc RNA）是一类长度大于200个核苷酸、无蛋白编码功能的RNA,能够在转录、转录后、翻译、翻译后等多个水平参与对靶基因的调控,进而发挥重要的生物学功能。Lnc RNA的异常表达可以影响胶质瘤的形成与进展,并且可以作为潜在的胶质瘤诊断及判断患者预后的分子标志物和治疗靶点。尽管目前已经确定了一些在胶质瘤中差异表达的lnc RNAs,并对其进行了较为深入的科学研究,但绝大多数lnc RNAs在胶质瘤发生、发展过程中的生物学功能和分子机制尚不明确。通过对课题组前期完成的胶质瘤基因芯片数据进行分析及筛选,我们发现LINC00909在胶质瘤组织中存在显著差异表达。LINC00909是一个新的长链非编码RNA分子,目前尚无其在肿瘤方面的研究报道。在本研究中,我们通过q RT-PCR证实LINC00909在胶质瘤组织中呈显著高表达,其表达水平的高低与胶质瘤WHO分级呈正相关。此外,Kaplan-Meier生存分析结果表明,LINC00909表达水平的升高与胶质瘤患者的不良预后相关。进一步通过体外细胞功能实验,我们发现干扰LINC00909的表达不仅可以抑制胶质瘤细胞的增殖、克隆形成、迁移和侵袭,还可以影响胶质瘤细胞的上皮-间质转化（EMT）过程。Lnc RNA在胶质瘤中的竞争性内源RNA（ce RNA）机制是当前研究的热点之一。作为mi RNA的分子“海绵,lnc RNA可以竞争性地结合mi RNA并调节其靶基因的表达,从而参与调控肿瘤细胞的生物学功能。因此,我们推测LINC00909在胶质瘤中也可能通过ce RNA机制发挥作用。通过生物信息学分析和荧光素酶报告基因实验等,我们发现LINC00909和编码基因MUC1的3’UTR区都存在mi R-194的结合位点。q RT-PCR和Western blot实验表明,干扰LINC00909可以使胶质瘤细胞中MUC1的m RNA和蛋白表达水平下调,而mi R-194抑制剂可以逆转这种作用。LINC00909作为ce RNA可能通过调节mi R-194/MUC1轴促进胶质瘤的进展。我们的研究结果表明,LINC00909有潜力成为胶质瘤的诊断标记物和治疗靶点。第一部分LINC00909在脑胶质瘤中的表达及临床意义研究目的:明确LINC00909在胶质瘤组织和正常脑组织中的表达情况,分析该lnc RNA的表达与患者术后生存预后及其他临床观测指标是否具有相关性,为证明其能否作为胶质瘤诊断和评估患者预后的分子标记物提供理论依据。方法:收集2014年-2016年上海长征医院手术切除获得的胶质瘤及正常脑组织标本112例（肿瘤组织102例,正常脑组织10例）,在RNA水平检测LINC00909在胶质瘤组织和正常脑组织中的表达水平;收集对应患者的临床信息和随访资料,统计分析该lnc RNA分子与患者术后生存预后及其他临床观测指标的相关性。结果:q RT-PCR结果表明,与正常脑组织相比,LINC00909在胶质瘤组织中的表达水平显著上调,并且在高级别胶质瘤组中的表达水平明显高于低级别胶质瘤组。结合患者各项临床指标进行统计学分析,我们发现LINC00909的表达水平与胶质瘤WHO分级呈正相关。生存分析结果表明,LINC00909的表达水平与患者的总生存时间呈负相关。单因素分析结果表明,LINC00909的表达水平与胶质瘤患者的生存预后具有显著的相关性。多因素COX回归分析结果表明,LINC00909的表达水平是影响患者预后的独立危险因素。结论:LINC00909在胶质瘤组织中表达水平显著上调,其表达水平的高低与胶质瘤WHO分级呈正相关,并且与患者的总生存时间呈负相关,是影响患者预后的独立危险因素。LINC00909能够作为潜在的胶质瘤诊断及评估患者预后的分子标记物。第二部分LINC00909在胶质瘤细胞中的生物学功能研究目的:研究LINC00909在胶质瘤的进展过程中发挥的生物学功能。方法:设计合成靶向LINC00909的小干扰RNA,将其转染胶质瘤细胞系U87MG和U251。通过MTT实验、克隆形成实验、Transwell迁移和侵袭实验以及Western blot实验等,观察干扰LINC00909的表达对胶质瘤细胞的