利用CRISPR/Cas9技术构建ApoE基因敲除的金黄仓鼠高脂血症模型

作     者：方光明 

作者单位：郑州大学 

学位级别：硕士

导师姓名：董建增

授予年度：2020年

学科分类：1002[医学-临床医学] 1001[医学-基础医学(可授医学、理学学位)] 100201[医学-内科学(含：心血管病、血液病、呼吸系病、消化系病、内分泌与代谢病、肾病、风湿病、传染病)] 10[医学] 

主      题：高脂血症 ApoE CRISPR/Cas9 金黄仓鼠 动脉粥样硬化 

摘      要：目的:高脂血症是一种由基因和环境因素共同引起的代谢性疾病,其主要危害是易引发动脉粥样硬化病变,由此导致的慢性心脑血管疾病已经是威胁人类健康的重要疾病之一。合适的动物模型是研究疾病的重要工具,本文主要是利用CRISPR/Cas9技术来建立ApoE基因敲除的新型金黄仓鼠高脂血症模型,并鉴定其表型。方法:载脂蛋白E(ApoE)是参与脂质代谢的一个关键基因。本实验利用CRISPR/Cas9基因编辑技术,设计了2对靶向金黄仓鼠ApoE基因第4个外显子的sg RNA(sg RNA 1,sg RNA2)。通过酶切和连接反应把合成的sg RNA序列连接到PX458质粒上构建sg RNA-质粒载体,Sanger测序和酶切反应验证质粒载体的正确性。用sg RNA-质粒载体转染BHK-21细胞后,通过荧光强度以及酶切反应验证sg RNA的敲除效率,选择效率高的sg RNA用于受精卵显微注射。把注射后的受精卵移植到代孕金黄仓鼠中,约2周后幼崽金黄仓鼠(即F0代)出生。待F0代金黄仓鼠生长至2周龄时,剪取脚趾做标记并收集脚趾组织用于提取基因组DNA和PCR扩增。PCR产物纯化后做载体克隆,挑取单克隆做Sanger测序以检测F0代金黄仓鼠的基因型。利用Benching软件预测潜在的脱靶位点,选取脱靶评分最高的前8个位点设计PCR引物进行扩增,Sanger测序分析脱靶现象。待金黄仓鼠生长至3周龄时,雌雄分开并单笼饲养。10周龄时把携带基因突变的F0与野生型金黄仓鼠交配繁殖出F1代金黄仓鼠。提取F1代仓鼠的基因组DNA后通过测序鉴定其基因型,并根据每种基因型的出现频率来分析母本F0的传代情况。把携带相同基因型的F1代金黄仓鼠雌雄交配繁殖F2代金黄仓鼠,测序鉴定F2代仓鼠的基因型后选取纯合突变型(ApoE)金黄仓鼠用于扩繁。把8周龄的金黄仓鼠隔夜禁食后,通过眼球后静脉取血并分离血清,用生化分析仪检测不同基因型金黄仓鼠的血脂水平。为了分析ApoE基因敲除对血脂代谢的影响,同时选取8-10周龄的野生型和纯合突变型金黄仓鼠,并将其各自分为两组(对照组和实验组),每组6-8只。其中对照组给予标准饲料,实验组给予高脂饲料(含0.5%的胆固醇和15%脂肪)。在高脂饮食处理后第4周和第8周,分别采集血液样品并检测血脂水平,以鉴定ApoE基因敲除金黄仓鼠模型在不同饮食条件下的表型特点。结果:我们设计了2对sg RNA并构建了sg RNA质粒载体,并用测序和酶切实验证实载体构建成功。通过体外细胞转染实验比较了二者的基因编辑效率,结果表明sg RNA2基因编辑效率较高。因此选用sg RNA2质粒载体进行受精卵显微注射,并把注射后的受精卵移植到代孕金黄仓鼠中。16天后获得了6只F0代金黄仓鼠,基因型鉴定结果证实,除了F0-6的基因型为野生型外,其余5只F0个体共携带了7种ApoE突变基因型,突变类型包括碱基删除和插入,整体编辑效率为(83.3%,5/6),且未检测到脱靶效应。根据传代特点和基因突变类型,最终选择了基因型为单碱基插入的F1代个体进行扩繁(来源于F0-5),建立了能稳定遗传的纯合型ApoE基因敲除(ApoE)的金黄仓鼠模型。表型鉴定结果表明,正常饮食的ApoE金黄仓鼠在8周龄时血脂水平即明显高于野生型金黄仓鼠,其中总胆固醇(TC)水平较野生型(WT)升高了1.75倍(461.81±107.10 mg/d L vs 167.74±21.64 mg/d L,P0.01),甘油三脂(TG)升高了53.36%(251.16±20.08 mg/d L vs 196.09±23.38 mg/d L,P0.01),而高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)未见明显变化,表明ApoE金黄仓鼠能自发形成高脂血症。与野生型相比,ApoE金黄仓鼠血脂水平未见明显异常。此外,高脂饮食处理能显著促进ApoE金黄仓鼠血脂代谢异常。高脂饮食处理4周时,其血液中的TC、TG和HDL-C分别为3730.21±416.72 mg/d L,1759.60±153.53 mg/d L和588.84±90.18 mg/d L,均显著高于WT高脂饮食组金黄仓鼠的TC(861.09±88.11mg/d L),TG(836.50±124.96 mg/d L)和HDL-C(121.36±21.50 mg/d L)的水平(P0.01)。高脂饮食处理8周时,ApoE金黄仓鼠的血液TC、TG和HDL-C的水平分别进一步升高至4214.67±341.96 mg/d L,2066.92±211.36 mg/d L和666.04±67.16 mg/d L,显著高于同期WT高脂饮食组的TC(961.45±69.45)、TG(925.00±139.08)和HDLC(129.85±15.84)的水平,P值均小于0.0001。同时,我们将各