关于蜡酯合成酶结构和生物活性的研究

作     者：肖一凡 

作者单位：北京化工大学 

学位级别：硕士

导师姓名：史硕博;孟赓

授予年度：2020年

学科分类：0710[理学-生物学] 071010[理学-生物化学与分子生物学] 081704[工学-应用化学] 07[理学] 08[工学] 0817[工学-化学工程与技术] 

主      题：蜡酯合成酶 蛋白纯化 结晶 蛋白突变 酶动力学 

摘      要：蜡酯合成酶是生物体内蜡酯合成的关键酶,存在于多种动植物和微生物中,依靠该酶可催化生成一系列结构各异且具有不同功用的蜡酯。随着人们对蜡酯合成酶的深入研究,人们发现不同物种中的蜡酯合成酶在功能与活性上有着较大的差异,这些差异导致了其合成产物及用途的多样性。目前研究最多的是研究最多的是海洋杆菌VT8和刺刀不动杆菌ADP1中的的蜡酯合成酶(Wax Synthase,WS)。这些酶已被几个实验室用于生物柴油和其他蜡酯的体内生产。本文研究了海洋杆菌VT 8中MhWS2基因表达的蜡酯合成酶WS2,主要研究结果如下:1.用pET11a构建了 WS2的表达载体并转入大肠杆菌BL21感受态细胞,使大肠杆菌中WS2蛋白高效表达(可溶性)。2.确定了表达WS2的最适的诱导条件是用0.8 mM的IPTG,在30℃、170 rpm条件下诱导18 h,每升大肠杆菌纯化后可得到最高10 mg的WS2单体蛋白和5 mg的WS2二聚体蛋白。3.通过对WS2蛋白进行结晶实验,初步确定了 WS2二聚体的结晶条件,并进行了部分优化,为进一步优化得出晶体做好铺垫。4.通过对WS2二聚体的酶动力学研究,得到了该酶二聚体参与反应的最适pH为8.5和最适温度为50℃;通过对WS2突变研究,得到突变体PLPQ,显著改变了 WS2对不同链长醇类的底物亲和力和反应效率,其中乙醇的催化效率提高约50倍。