ATP诱导NLRP3炎症小体途径受阻的巨噬细胞发生焦亡的机制研究

作     者：曾琛莹 

作者单位：暨南大学 

学位级别：硕士

导师姓名：何贤辉

授予年度：2019年

学科分类：1001[医学-基础医学(可授医学、理学学位)] 100102[医学-免疫学] 10[医学] 

主      题：细胞焦亡 Caspase-3 Gasdermin E ATP 巨噬细胞 

摘      要：目的:ATP是NLRP3炎症小体的经典激动剂之一,可诱导巨噬细胞通过Caspase-1/Gasdermin D(GSDMD)途径发生焦亡。然而,在因病原体的感染而导致NLRP3炎症小体活化受阻的巨噬细胞中,ATP能否诱导细胞发生焦亡,目前尚不明确。本课题利用ASC缺陷的RAW 264.7细胞系及NLRP3炎症小体特异性抑制剂MCC950预处理的骨髓源性的巨噬细胞(BMDM)作为体外细胞模型,再用ATP对细胞进行刺激,探究当巨噬细胞中NLRP3炎症小体活化受阻时细胞的死亡方式。方法:由于细胞发生焦亡(一种裂解性死亡)时会发生明显的形态学变化,细胞会发生肿胀,最终导致胞膜破裂及细胞内容物释放,因此可用碘化丙锭(PI)染色法检测BMDM及RAW 264.7细胞的裂解性死亡;进一步采用免疫印迹法检测上述两种细胞模型上清中Caspase-1、IL-1β的表达水平,以及细胞裂解物中pro-Caspase-1、pro-IL-1β、GSDMD、Gasdermin E(GSDME)以及凋亡相关的Caspases蛋白的表达水平;利用特异性抑制剂DEVD抑制Caspase-3的活性,或siRNA敲低Caspase-3、GSDME的表达,进而采用PI及免疫印迹法检测细胞坏死率及焦亡通路相关蛋白的表达水平。结果:ATP可时间依赖性诱导RAW 264.7细胞及NLRP3炎症小体活化受阻(MCC950处理)的BMDM细胞发生裂解性死亡,但不引起NLRP3炎症小体活化介导的焦亡经典途径中Caspase-1及GSDMD的活化,却可引起凋亡相关的启动蛋白Caspase-8和Caspase-9以及凋亡相关的执行蛋白Caspase-7和Caspase-3的活化,最终引起GSDME蛋白的活化,诱导细胞发生Caspase-3/GSDME途径依赖的裂解性死亡;Caspase-3特异性的抑制剂DEVD可降低ATP诱导的细胞死亡率,并下调GSDME蛋白的活化;与此同时,siRNA敲低GSDME可降低ATP诱导的细胞死亡率及HMGB1蛋白在上清中的分泌水平。siRNA敲低Caspase-3可降低ATP诱导的细胞死亡率。结论:当机体组织损伤或受到感染时,ATP作为常见的损伤相关的分子模式,可在NLRP3炎症小体活化受阻时,通过Caspase-3/GSDME途径诱导巨噬细胞发生焦亡,提示另一种潜在的宿主对抗病原体逃逸的细胞焦亡机制。