STAT3信号通路通过下调CyclinD1、VEGF参与早期自然流产发病的机制研究

作     者：方媛 

作者单位：安徽医科大学 

学位级别：硕士

导师姓名：魏兆莲

授予年度：2020年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100211[医学-妇产科学] 10[医学] 

主      题：自然流产 复发性流产 滋养细胞 血管生成 STAT3 CyclinD1 VEGF 

摘      要：目的:检测STAT3信号通路及其下游基因Cyclin D1、VEGF等,以及血管生成的重要受体蛋白VEGFR1在正常人群、早期自然流产人群及早期复发性流产人群的流产组织（绒毛及蜕膜）中的表达水平,探索STAT3通路可能参与的自然流产的发病机制。方法:选择2017年12月018年8月于安徽医科大学第一附属医院妇产科人工流产手术室行无痛人工流产的患者80例,其中因社会性因素自愿行人工流产的30名健康妇女为对照组,30名因胚胎停育或自然流产的患者为早期自然流产组（EUSA组）,另20名患者因与同一性伴侣发生过两次或以上的自然流产被定义为早期复发性流产组（EURSA组）。三组人群均为早期妊娠（妊娠6-9周）行无痛人流术,收集三组患者的绒毛组织及蜕膜组织。使用苏木精-伊红染色法观察三组绒毛组织在病理学上的表现差异。应用免疫组织化学染色、蛋白质印迹法、实时定量聚合酶链式反应等方法分别检测三组绒毛组织和蜕膜组织中磷酸化STAT3（p-STAT3）、Cyclin D1、VEGF及VEGFR1的表达差异。选择人绒毛膜外滋养细胞系（HTR-8/SVneo）建立绒毛外滋养细胞模型进行细胞部分的实验。使用不同浓度的STAT3信号通路抑制剂AG490（0,6.25,12.5,25,50,100μM）分别处理HTR-8/SVneo细胞24小时,48小时和72小时。倒置光学显微镜下拍摄不同浓度抑制剂作用48小时下的细胞生长状态,并使用蛋白质印迹法（Western blot）、实时定量聚合酶链式反应（q-PCR）分别检测梯度浓度抑制剂培养环境下的p-STAT3、Cyclin D1、VEGF的表达水平。使用CCK-8试剂盒检测梯度浓度抑制剂作用48小时后细胞的增殖情况,并且通过流式细胞术分析不同浓度药物对STAT3通路抑制的情况下,绒毛滋养细胞的凋亡情况。另外使用蛋白质印记法检测不同程度STAT3通路抑制作用下绒毛滋养细胞VEGFR1的表达情况,探索抑制STAT3通路后滋养层细胞血管生成能力的变化。结果:1.对照组与两组实验组（EUSA组和EURSA组）患者一般情况的比较三组患者在年龄、BMI、孕次、产次、停经时间上无统计学差异（p0.05）。2.三组绒毛组织HE染色的病理学差异与对照组相比,EUSA组和EURSA组的绒毛组织经HE染色可观察到滋养细胞数量减少,部分细胞呈现核固缩现象,凋亡数量增加。3.Cyclin D1、VEGF及VEGFR1在三组绒毛组织中的表达免疫组织化学染色显示Cyclin D1、VEGF及VEGFR1在正常对照组的绒毛组织中染色明显强于EUSA组和EURSA组;同时在蛋白水平（Western blot的结果）和m RNA水平（q-PCR结果）表明Cyclin D1、VEGF及VEGFR1在EUSA组和EURSA组的蜕膜显著低于对照组（p0.05）;4.Cyclin D1、VEGF及VEGFR1在三组蜕膜组织中的表达通过免疫组织化学染色、Western blot、q-PCR的实验结果,显示Cyclin D1、VEGF及VEGFR1在正常对照组的蜕膜组织中表达明显高于EUSA组和EURSA组（p0.05）。5.STAT3的激活状态,即p-STAT3在三组绒毛及蜕膜中的表达免疫组织化学染色显示p-STAT3在正常对照组的绒毛组织和蜕膜组织中的特异性染色明显强于EUSA组和EURSA组。当每个组中的STAT3大致相同时,p-STAT3的蛋白水平在EUSA组和EURSA组（绒毛和蜕膜组织）中均呈下降趋势。6.抑制STAT3通路的激活对滋养细胞增殖的影响在使用梯度浓度抑制剂（0,6.25,12.5,25,50,100μM）AG490培养HTR-8/SVneo细胞48小时后,STAT3的磷酸化被显著抑制（Western blot结果）,倒置荧光显微镜下拍摄添加不同浓度抑制剂作用下滋养细胞的生长情况,随抑制剂浓度的增加,滋养细胞增殖减少,凋亡数量增多。CCK-8实验及流式细胞术检测结果显示,抑制STAT3通路的激活,使滋养细胞整体增殖受限,凋亡加剧。7.随着STAT3的激活被梯度抑制,Western blot实验结果表明Cyclin D1和VEGF的表达相应降低,且具有剂量依赖性。8.Western blot结果表明血管生长因子相关受体VEGFR1的表达在STAT3通路被抑制后,呈现下降趋势,具有剂量依赖性。结论:这项研究的结果表明,不明原因自然流产患者的绒毛组织和蜕膜组织中STAT3通路受到明显抑制,STAT3的下游调控蛋白Cyclin D1及VEGF表达降低,导致滋养层细胞生长受限,凋亡增加,且血管生成的重要受体VEGFR1的水平下降,进而导致绒毛滋养细胞外血管生成受损,影响早期胚胎的生长和发育,从而引发流产,这可能为部分不明原因的自然流产患者的临床治疗提供一定的指导作用。