通过蛋白组学方法初步筛选影响疟原虫配子体感染活力的基因
作者单位：中国医科大学
学位级别：硕士
导师姓名：郑丽
授予年度：2020年
学科分类：1002[医学-临床医学] 100201[医学-内科学(含：心血管病、血液病、呼吸系病、消化系病、内分泌与代谢病、肾病、风湿病、传染病)] 10[医学]
摘 要：目的:疟疾是疟原虫通过媒介昆虫蚊传播的最为严重的寄生原虫感染性疾病,有数十万人因罹患疟疾而死亡。疟原虫的发育经历肝内期、红内期和蚊内期三个发育阶段,以及脊椎动物和昆虫蚊两任宿主。配子体是连接疟原虫脊椎宿主和蚊宿主之间的唯一桥梁,是导致人蚊传播的关键。在疟原虫发育过程中,存在自然传播阻断现象,即随着疟原虫的增殖,配子体数量增加但配子体的感染力却出现降低的现象。说明配子体是疟原虫发育过程中的重要环节,探讨其在自然传播阻断现象中的机制,无疑为阻断人蚊传播、根治疟疾疾病提供新的科研思路及解决方法。本研究通过蛋白质组学方法比较感染后不同时间疟原虫配子体表达蛋白的差异,初步筛选影响疟原虫配子体活力的相关蛋白基因,并通过基因重组技术对候选基因进行生物学功能预判。研究方法:1.鼠疟模型建立及配子体活力检测。6-8周,雌性BALB/c小鼠腹腔注射1×10个野生型约氏疟原虫(Plasmodium yoelii)和伯氏疟原虫(Plasmodium berghei)感染红细胞,感染后第2天动态监测小鼠红细胞感染率及配子体率;雄配子出丝情况;体外动合子培养数量。2.筛选感染不同时间疟原虫配子体表达差异的蛋白基因。密度梯度离心法纯化感染后第3天和第5天疟原虫成熟裂殖体和配子体蛋白,通过胰酶酶解,Tandem Mass Tag?(TMT)标记,高效液相色谱分级,液相色谱—质谱串联分析,以1.5为差异系数,获得疟原虫不同时间配子体蛋白表达差异的基因。通过蛋白质组学分析和网络信息资源查询对差异蛋白进行生物信息学预判及蛋白功能评估。***标签基因重组虫株的建立。通过基因双交叉同源重组技术构建HA标签虫株,电转染质粒到成熟疟原虫裂殖体,静脉注射感染小鼠,通过乙胺嘧啶抗药特性筛选重组虫株,提取基因组进行PCR鉴定。4.候选基因基本生物学分析。间接免疫荧光实验(IFA)确定HA标签虫株蛋白的定位及表达时期;免疫印迹技术(WB)验证HA标签虫株蛋白的分子量。结果:1.鼠疟模型模拟自然传播阻断现象,野生型约氏和伯氏疟原虫配子体率随感染率上升而上升,出丝和动合子数量在感染后第3天计数最多。活力在第3天有一个峰值随后呈下降趋势,并不随感染率上升而上升。2.蛋白质组学结果提示,随着原虫感染的进程,蛋白表达下调的基因主要出现在配子体期。疟原虫感染后第5天和感染后第3天相比有167个蛋白表达上调,106个蛋白表达下调。通过PlasmoDB数据库预测167个上调基因中有红内期转录基因101个,配子体期转录基因29个,两个时期均有的基因37个。红内期转录基因占总上调基因的82.63%;106个下调基因中红内期转录基因9个,配子体期转录基因81个,两个时期均有的基因为16个。配子体期转录基因占总下调基因的91.51%。3.下调蛋白进行功能域分析发现,其功能主要集中在以下几类:三磷酸水解酶结构域,Dynein结构域,Kinesin结构域,6半胱氨酸(6-Cys)和富含亮氨酸的结构域。这些结构在配子体发育及雌雄配子体结合过程中都具有极其重要的作用。4.网络信息资源筛选影响配子体功能的基因,通过网络信息资源评估8个配子体期下调基因,结构上具有信号肽,跨膜蛋白或GPI结构,功能预测具有结构域功能的基因作为优先研究的候选基因,初步筛选20个符合以上条件的基因。其中P48,P230等满足以上条件的基因已证明是疟原虫配子体发育过程中具有重要功能的基因。5.候选基因功能预测。通过基因重组技术成功构建HA标签虫株5个;其中Pb120990号基因完成分子量鉴定和蛋白定位。结论:1.蛋白质组学实验证实随着感染进程疟原虫配子体具有重要生物学功能的蛋白表达下调,这些表达下调的蛋白减弱了疟原虫配子体的活力;2.蛋白质组学结果提示疟原虫感染过程中存在自然传播阻断现象,其出现时期发生在脊椎动物宿主感染时期;3.通过蛋白质组学实验结合网络信息资源筛选和基因重组实验验证,能够为揭示自然传播阻断现象的机制提供实验室依据。
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