使用无标记LC-MS/MS对寻常型银屑病患者的皮肤屏障功能相关蛋白进行无创性定量蛋白组学分析

作     者：章婧 

作者单位：安徽医科大学 

学位级别：硕士

导师姓名：杨森

授予年度：2020年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100206[医学-皮肤病与性病学] 10[医学] 

主      题：无创性 皮肤蛋白 皮肤屏障 银屑病 质谱法 

摘      要：研究背景银屑病通常被认为是一种免疫学引发的疾病,近些年的很多的研究发现银屑病可能是由于表皮皮肤屏障功能的主要缺陷“驱动。皮肤屏障的功能通常指表皮,尤其是角质层的皮肤屏障功能结构,角质层的各种蛋白质是角质层的皮肤屏障结构的重要生化组成。与蛋白质的任何异常表达都会影响着银屑病的皮肤屏障功能。角蛋白(keratin,KRT)是表皮细胞的主要结构蛋白,呈纤维状,与丝聚合蛋白(filaggrin,FLG)形成致密的角蛋白纤维束组成角质层的支架结构。丝聚合蛋白(FLG)与兜甲蛋白(loricrin,LOR)、内披蛋白(involucrin,IVL)、毛透明蛋白以及富含脯氨酸的小蛋白(small proline rich region protein,SPRRs)等蛋白质一起,在转谷氨酰胺酶(transglutaminas,TGs)的交叉连接作用下形成角化包膜(cornified envelope,CE)。角化包膜在对抗外界机械张力、防止病原生物入侵、保持角质层内外水平衡方面中有发挥着重要的作用,有效的防止外界有害物质对皮肤的入侵,是角质层作为一道防御屏障的基础。位于颗粒层的丝聚合蛋白原在半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶-14(cysteiyl aspartate specific proteinase,Caspase-14)的作用下转化成有生物学活性的丝聚合蛋白,并主要集中在角质层,丝聚合蛋白在角质层的多种蛋白水解酶作用下进一步降解成游离的氨基酸,例如尿刊酸、吡咯烷酮-5-羧氨酸、鸟氨酸、瓜氨酸、天冬氨酸等这些氨基酸有很强的亲水性,形成天然保湿因子的主要组成部分,在维持皮肤角质层的水合功能,保湿方面发挥着重要作用。除了上述角蛋白和角蛋白相关蛋白外,S100A蛋白、紧密连接蛋白(tight junction,TJ)等都被研究发现在维持皮肤屏障功能中发挥着重要作用。以上这些与角质层皮肤屏障功能密切相关的蛋白角蛋白、丝聚合蛋白、兜甲蛋白、内披蛋白、S100A蛋白、SPRRs、转谷氨酰胺酶等与银屑病的关联也成为一个研究热点。目前在该领域的研究方法主要是皮肤活检术结合免疫组化的方法。研究目的本研究旨在通过无创方法采集正常人和寻常型银屑病病人的角质层皮肤样本,使用液相色谱-串联质谱法(liquid chromatography with tandem mass spectrometry,LC-MS/MS)对角质层中的蛋白进行无标记定量分析,探寻寻常型银屑病患者与正常人角质层中皮肤屏障功能相关蛋白表达的差异,为今后更深入地研究银屑病的皮肤屏障功能相关蛋白提供一个很好的方法学。实验材料与方法使用3L医用压敏胶带粘取实验组寻常型银屑病患者前臂屈侧皮损区皮肤,对照组同样使用3L医用压敏胶带粘取对照组正常人前臂屈侧皮肤。对两组胶带上的蛋白质进行收集、提取、酶解,对被胰蛋白酶降解过的肽混合物使用高分辨质谱分析仪进行LC-MS/MS分析。最后用Max Quant进行无标签数据库搜库,采用Max LFQ算法,得出每个样本最终结果。结果在本实验的中银屑病病人组检出1102种蛋白,正常人组检出106种蛋白。通过统计对比分析正常人组和寻常型银屑病患者组的每种蛋白的蛋白峰面积值,发现其中有41种与皮肤屏障功能密切相关的蛋白的蛋白峰面积值,在两组之间存在明显差异,差异有统计学意义。结论与正常人对比寻常型银屑病皮肤屏障的相关蛋白KTR1、KRT2、KRT5、KRT6A、KRT6B、KRT8、KRT9、KRT10、KRT14、KRT16、KRT17、KRT72、SPRR1A、SPRR2D;SPRR2BSPRR2F、SPRR1B、SPRR2E、SPRR2A、IVL、FLG2、TGM3、TGM1、TGM5、LCE3E、LCE3D、LOR、FLG、Caspase-14、S100A8、S100A9、S100A7、S100A7A、S100A3、S100A11、S100A16、S100A2、桥斑蛋白(desmoplakin,DSP)、桥粒芯蛋白1(desmoglein1,DSG1)、桥粒芯蛋白3(desmoglein3,DSG3)、TPJ1、TPJ2表达差异明显,这些蛋白的表达差异影响了寻常型银屑病患者的角质形成细胞的分化、增殖,影响了寻常型银屑病患者的表皮屏障功能,同时寻常型银屑病的相关炎症因子也影响着这些皮肤屏障功能相关蛋白的表达。本次研究采用的是无创取材的研究方法区别于常用的有创皮肤活检取材,同时结合无标记LC-MS/MS这种最新的蛋白组学技术,有着无创、灵敏度高、准确性高的特点。为未来加深拓展对皮肤屏障蛋白与寻常型银屑病的相关研究提供了很好的方法学。