miR-656-3p靶向ATP10A基因调控阿尔茨海默病模型细胞凋亡的分子机制

作     者：朱竹君 

作者单位：江苏大学 

学位级别：硕士

导师姓名：于明

授予年度：2020年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100203[医学-老年医学] 10[医学] 

主      题：阿尔茨海默病 miR-656-3p 增殖 凋亡 ATP10A 双荧光素酶 

摘      要：背景阿尔茨海默病(AD)又称为老年痴呆,其发生、发展及病理改变过程与环境、遗传因素等紧密相关,但其病理演进过程的分子机制尚不十分明确。微小RNAs(miRNAs)是一类长约18-25nt、广泛表达于哺乳动物中非编码小RNA分子,具有高度保守性,含有与下游靶基因mRNA的3,非翻译区互补的碱基序列,可抑制或降解靶基因mRNA,从而调控转录后水平。有研究表明,机体中约超过70%mRNA可表达于脑部组织,调控神经相关细胞的生长、分化。研究证实,多种miRNA在AD演进过程中表达量异常,但具体的分子机制尚不清楚。本研究旨在探讨miR-656-3p在AD中的作用及相关机制,为进一步阐明AD发生发展的分子机制提供理论基础以及临床上新药的研发提供潜在分子靶位点。第一部分miR-656-3p调控阿尔茨海默病模型细胞凋亡作用的研究目的探究miR-656-3p在AD模型细胞增殖、凋亡中的调控作用。方法体外培养SH-SY5Y细胞,采用不同浓度Aβ(0μmol/L、5μmol/L、10μmol/L、20μmol/L)诱导SH-SY5Y细胞构建AD细胞模型。将SH-SY5Y细胞随机分为对照组(正常培养的SH-SY5Y细胞)、模型组(10μmol/L Aβ诱导SH-SY5Y细胞构建的AD细胞模型)、NC组(模型组细胞经脂质体Lipofectamine 2000转染NC)、miR-656-3p组(模型组细胞经脂质体Lipofectamine 2000转染miR-656-3p mimics)。MTT实验检测细胞的增殖活性;qPCR检测不同浓度Aβ(0μmol/L、5μmol/L、10μmol/L、20μmol/L)诱导SH-SY5Y细胞以及10μmol/L Aβ作用不同时间(0 h、24 h、48 h、72 h)miR-656-3p的表达量;转染miR-656-3p mimics过表达miR-656-3p的表达量,qPCR实验观察转染效果;流式细胞术检测细胞的凋亡率。结果Aβ显著降低SH-SY5Y细胞的增殖活性,具有一定的浓度依赖性,显著抑制miR-656-3p表达量(P0.05),10μmol/L Aβ作用SH-SY5Y细胞24 h时miR-656-3p表达量变化较大,因此选取10μmol/L Aβ诱导SH-SY5Y细胞制作AD细胞模型;与对照组相比,模型组细胞显著抑制细胞增殖、促进细胞凋亡(P0.05),过表达miR-656-3p则促进模型细胞的增殖活性、抑制细胞凋亡(P0.05)。结论miR-656-3p在AD模型细胞中表达量降低;过表达miR-656-3p可促进AD模型细胞增殖,抑制其凋亡,从而对AD发挥保护作用。第二部分miR-656-3p靶基因的相关研究目的本研究主要探讨miR-656-3p调控AD模型细胞增殖、凋亡的下游靶基因。方法通过Target Scan在线数据库预测miR-656-3p与下游靶基因结合,选取ATP10A作为下游靶基因;双荧光素酶报告基因验证miR-656-3p和ATP10A的靶向结合关系,q PCR和Western blot检测过表达和敲低miR-656-3p对ATP10A m RNA和蛋白水平的影响;观察敲低ATP10A对细胞增殖、凋亡的影响。结果在线数据库预测结果显示,miR-656-3p与ATP10A的3,-UTR端部分碱基存在互补现象;双荧光素酶报告基因验证miR-656-3p与ATP10A具有结合位点;过表达和敲低miR-656-3p对ATP10A m RNA水平无显著影响,但可显著调节ATP10A蛋白水平(P0.05);敲低ATP10A显著促进模型细胞的增殖活性、抑制其凋亡(P0.05)。结论ATP10A是miR-656-3p的下游靶基因之一;miR-656-3p负反馈调节ATP10A蛋白的表达量;敲低ATP10A与上调miR-656-3p具有相似的作用,均可显著促进细胞的增殖、抑制其凋亡(P0.05)。第三部分miR-656-3p靶向ATP10A基因调控阿尔茨海默病模型细胞的凋亡目的本研究主要探讨miR-656-3p通过调控ATP10A影响AD模型细胞的凋亡。方法过表达miR-656-3p和ATP10A以及敲低miR-656-3p和ATP10A共转染模型细胞,Western blot检测转染后ATP10A蛋白的表达量,MTT和流式细胞术检测细胞增殖、凋亡的变化。结果与NC组相比较,过表达miR-656-3p显著降低ATP10A蛋白水平(P0.05);敲低miR-656-3p较anti-NC组显著增加ATP10A蛋白水平(P0.05);miR-656-3p+ATP10A组可逆转miR-656-3p对ATP10A蛋白水平、凋亡率的抑制和促进增殖的作用(P0.05);anti-miR-656-3p