外源线粒体纠正四氯化碳诱导的肝纤维化与治疗机制研究
作者单位：西南大学
学位级别：硕士
导师姓名：付爱玲
授予年度：2020年
学科分类：1007[医学-药学(可授医学、理学学位)] 1006[医学-中西医结合] 100706[医学-药理学] 100602[医学-中西医结合临床] 10[医学]
摘 要：肝纤维化可由多种致病因素(病毒、化学毒物、过度肥胖等)引起,是一种组织创伤愈合后发生的组织损伤,主要表现为肝内结缔组织异常增生。随着病情的持续发展,会进一步引起肝硬化,甚至肝癌,严重影响机体健康。肝纤维化过程中肝细胞出现广泛的线粒体损伤,表现为能量生成受阻、氧自由基大量释放、自噬功能改变、线粒体DNA受损等,这是引起肝功能障碍的重要因素。所以本课题尝试从纠正肝脏线粒体受损状态的角度出发,使用功能正常的线粒体替代原本功能缺陷线粒体,以恢复细胞内线粒体活性,改善肝组织功能。本研究使用化学毒物四氯化碳,模拟肝纤维化发展过程(四氯化碳能够攻击细胞膜,引起氧化应激损伤肝细胞,激活细胞外基质大量增生,导致肝纤维化的发生)。治疗药物由同种属健康小鼠肝脏中提取得到高纯度且具有良好活性的线粒体,在实验中把这种同种异体提取得到的线粒体称为外源线粒体。体外实验首先探究了外源线粒体进入肝细胞的方式。实验使用荧光染料标记外源线粒体以追踪其动态位置,发现使用大胞饮抑制剂阿米洛利处理肝细胞后,明显减少了肝细胞摄取外源线粒体的数量,因此判断外源线粒体进入肝细胞的途径可能是通过大胞饮的细胞胞吞方式进行的。接下来,为探究外源线粒体对损伤后的肝细胞的治疗效果,实验使用四氯化碳与肝细胞共孵育8 h诱导细胞损伤模型,向受损肝细胞补充功能正常的外源线粒体后,检测线粒体和细胞功能的恢复情况。结果表明,外源线粒体处理2-4 h且浓度在200-400 μg/mL之间对受损肝细胞具备明显的治疗效果,并且治疗效果存在浓度依赖性-随着线粒体浓度的提高对恢复细胞状态有正向调节作用;同时也发现外源线粒体的加入可以降低其培养液中谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)的水平并升高细胞内三磷酸腺苷(ATP)水平,证明外源线粒体可以减轻肝细胞损伤,恢复肝细胞内线粒体的生理功能。体内实验首先研究了外源线粒体通过尾静脉注射后在机体内部各组织器官的分布情况。通过向健康小鼠长期多次腹腔注射四氯化碳诱导小鼠肝纤维化模型,使用荧光染料标记的外源线粒体注入纤维化小鼠与正常小鼠体内,经2h体内分布后,检测外源线粒体在心、肺、肝、肾、脑中的分布情况。结果发现外源线粒体在肝脏组织中分布最多,且与非损伤正常肝脏相比,纤维化的肝脏中易获取更多外源线粒体。此外,实验还探究了短期单剂量补充外源线粒体后对受损肝脏内线粒体活性的影响。向肝纤维化小鼠体内注射外源线粒体2h后,检测肝脏中线粒体的膜电位与琥珀酸脱氢酶活性。发现与纤维化模型组相比,外源线粒体的加入显著提高了线粒体琥珀酸脱氢酶活性,轻微上调线粒体膜电位。上述结果提示线粒体疗法在减轻肝纤维化、恢复线粒体功能中具有可行性。为进一步探究外源线粒体在肝纤维化疾病中的治疗效果,实验使用外源线粒体对肝纤维化小鼠进行一周的干预性治疗。结果证明在额外补充功能性线粒体后,小鼠的肝脏系数降低,外源线粒体可能缓解了过度纤维沉积引起的肝淤血和肝水肿情况。并且,线粒体治疗后肝表面由粗糙逐渐向光滑转变,肝脏内部实质性细胞坏死减少、组织中炎性浸润降低、纤维化程度下降,肝脏形态得到了恢复。通过检测小鼠血液指标,发现线粒体治疗后,血清中ALT水平下降,说明小鼠肝损伤程度降低。通过检测小鼠肝组织匀浆液中相关指标,发现线粒体治疗后肝脏中超氧化物歧化酶(SOD)水平上升、活性氧(ROS)和羟脯氨酸(HYP)水平下降,说明外源线粒体提高了清除氧自由基的能力、减轻了肝脏纤维化程度。使用天狼星红对胶原纤维沉积进行特征性染色,进一步证明了外源线粒体在减轻肝纤维化进程中的发挥了良性作用。通过电子显微镜观察肝内超微结构,发现外源线粒体治疗后肝内线粒体含量明显增加、肿胀线粒体减少,说明外源线粒体改善了肝细胞内的线粒体的数量与状态。为深入探究外源线粒体在四氯化碳诱导的肝纤维化疾病中的治疗机制。实验通过对比疾病模型小鼠和线粒体治疗小鼠的肝脏中mRNA差异,分析GO与KEGG富集改变以及具体差异表达基因,发现氧化应激与细胞周期相关基因和信号通路在外源线粒体处理前后存在显著差异。因此,我们推测外源线粒体主要通过减轻肝脏氧化应激损伤、抑制肝星状细胞增殖这两个方面在肝纤维化的治疗中发挥作用。
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