MORC2在诱导肌细胞C2C12分化中的作用及其机制研究

作     者：郑建宇 

作者单位：中国医科大学 

学位级别：硕士

导师姓名：王桂玲

授予年度：2020年

学科分类：0710[理学-生物学] 07[理学] 071009[理学-细胞生物学] 09[农学] 0901[农学-作物学] 090102[农学-作物遗传育种] 

主      题：小鼠成肌细胞 细胞分化 MORC2 MyoD Id3 核质分布 

摘      要：目的:MORC2是Microrchidia家族CW型锌指蛋白(MORC)家族成员之一。MORC家族在进化上高度保守,并因其在抑制转录、表观遗传调控和DNA损伤修复等方面的重要功能引起人们的广泛关注。MORC2蛋白是一种普遍表达的蛋白,结构上主要包含ATPase域,CW锌指型结构域,核定位信号和卷曲螺旋结构域四个部分,分子量约为117kD。它在染色质重塑、DNA损伤修复和脂肪生成以及肿瘤的发生发展中发挥着重要作用。MORC2主要定位于细胞核,但在细胞质中也有少量分布,有研究表明MORC2在细胞质的定位是脂质代谢和体内平衡的关键参与者,能够调节细胞质中脂肪细胞分化和脂肪生成。而研究表明蛋白的核质分布的改变往往伴随着结构和生物学功能的转变。C2C12细胞是由C3H小鼠骨骼肌卫星细胞永生化而来的细胞株,属于小鼠的骨骼肌干细胞。该细胞具有与骨骼肌前祖细胞相同的生物学行为,且其细胞特性和形态均一,可无限传代培养。C2C12细胞在2%马血清培养条件下具有单向分化为肌细胞的能力,同时能够表达MyoD、myogenin、myosin等成熟骨骼肌的多种标志蛋白。因而在肌细胞发育分化研究中,常常把它视为实验经典模型。在肌细胞的分化过程中成肌调节因子(MRFs)起着至关重要的作用。它主要包括MyoD、Myf5、myogenin与MRF4四个成员,其中MyoD、myogenin与myosin常在成熟肌细胞中表达上调因此常被用做肌细胞分化标志物。由于他们在分化的不同阶段分别起着主导作用,因此在分化前期高表达的MyoD、myosin常被用做早期分化标志物,而在分化中晚期高表达的myogenin则被用做中期分化标志物。分化抑制因子3(Inhibitor of differentiation,Id3)首先发现于成肌细胞。与肌细胞分化标志物MyoD一样,均属于碱性螺旋-环-螺旋(bHLH)转录因子家族成员。Id分子在结构上缺少与DNA结合所必需的碱性区,因此能够阻断细胞的分化进程,诱导细胞的进一步增殖。通常分化程度越高,Id分子表达越少。此前有研究表明MyoD的过表达能够促进Id3的上调。而Id3能够通过干扰Myo D二聚化影响其活性并发挥抑制分化作用。研究表明Id3在C2C12分化过程中表达逐渐下调。我们在前期工作中发现过表达MORC2能够抑制C2C12细胞分化,但具体作用机制尚不明确。此外基因芯片结果显示在正常细胞培养条件下MORC2能够上调Id3的表达,但这是否能影响细胞分化尚不清楚。因此本研究在前期工作的基础上,深入探讨了MORC2对C2C12细胞诱导分化的作用及其机制。方法:构建过表达MORC2慢病毒载体;构建并筛选稳转过表达MORC2蛋白的细胞株;用2%马血清对构建成功的C2C12细胞系进行诱导分化;流式细胞仪检测诱导分化后细胞周期的变化;Real-time PCR检测诱导分化后肌细胞分化标志物MyoD及Id3 mRNA水平表达的变化;Western Blot检测诱导分化后MyoD及Id3蛋白表达的变化;荧光显微镜下观察MORC2在分化过程中的细胞定位转变;通过核质分离试剂盒分别检测分化过程中核质中MORC2、Id3蛋白表达变化。结果:(1)将双酶切获得MORC2目的基因片段与载体连接,获得重组质粒。(2)重组慢病毒载体经双酶切以及基因测序鉴定显示构建成功。(3)用收集的慢病毒上清液感染C2C12细胞,并筛选稳定表达株。(4)Real-time PCR和Western Blot鉴定结果显示MORC2在C2C12细胞中高表达。(5)细胞形态统计分析结果显示过表达MORC2组细胞分化程度明显低于对照组。(6)流式周期结果显示随诱导分化时间延长对照组细胞G0/G1期比例明显升高,S期比例下降,而过表达MORC2组细胞周期变化不明显。(7)随诱导分化时间延长,过表达MORC2组细胞肌分化标志物MyoD、myogenin和myosin上调幅度明显低于对照组(p0.05)。(8)正常生长(GM)培养条件下过表达MORC2能上调C2C12细胞中Id3的表达。而在诱导分化(DM)条件下,与对照组相比过表达MORC2能明显上调Id3的表达。(9)诱导分化后第3天的细胞中MORC2荧光分布发生了由细胞核到细胞浆的改变。(10)Western Blot结果显示,诱导分化过程中细胞核内MORC2蛋白表达逐渐减少,细胞质内MORC2逐渐升高。结论:(1)成功构建了携带MORC2基因的慢病毒载体。(2)过表达MORC2能够抑制细胞分化进程,促进C2C12细胞维持增殖状态。(3)在诱导分化过程中过表达MORC2能降低分化标志物MyoD、myogenin和myosin的上调水平。(4)过表达MORC2能上调Id3表达。(5)MORC2的定位在C2C12细胞诱导分化的过程中发生了由