搭载神经营养因子的聚己内酯纳米纺丝共聚物对脊髓损伤的修复作用

作     者：王磅博 

作者单位：中国人民解放军陆军军医大学 

学位级别：硕士

导师姓名：冯华

授予年度：2020年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100210[医学-外科学(含：普外、骨外、泌尿外、胸心外、神外、整形、烧伤、野战外)] 08[工学] 080501[工学-材料物理与化学] 0805[工学-材料科学与工程（可授工学、理学学位）] 080502[工学-材料学] 10[医学] 

主      题：脊髓损伤 细胞因子 聚己内酯(PCL)水凝胶复合物 层粘连蛋白 轴突再生 组织工程 

摘      要：研究背景脊髓损伤(Spinal cord injury,SCI)是一种严重的公共健康问题,全世界每年大约有25万-50万例新发病例。高处坠落、车祸、运动性伤害以及暴力等外界物理因素突然作用于脊髓,一系列复杂的病理生理变化随之发生,从急性期和亚急性期的出血、胶质细胞和神经元的坏死、自由基的释放、炎症细胞的浸润,到慢性期胶质瘢痕以及囊性空洞的形成、神经细胞生长因子以及轴突生长底物的缺乏,等严重阻碍了脊髓的结构和功能恢复。这不仅给患者带来灾难性的身心创伤,而且由于他们长期住院,康复效果欠佳以及对护理的过度依赖,给社会及其家庭带来了沉重的经济负担。在过去的一个世纪以来,在SCI机制方面研究的进步促进了临床干预的发展。大剂量激素使用、外科手术减压和康复训练降低了SCI患者的致残率,并改善了其功能结局。然而,临床疗效与理想相距甚远。在全球越来越重视科研的前提下,过去的几十年见证了一系列SCI基础研究的发展,比如神经保护性药物、细胞移植、生物组织工程、深部电刺激以及脑机接口等。这些研究为SCI患者带来了希望。用于桥接局部缺损组织、为组织生长提供支架的组织工程技术也成为研究的焦点。迄今为止,胶原蛋白、透明质酸、壳聚糖、聚乳酸-乙醇酸等各种生物相容性材料已被用于脊髓损伤的修复研究中。然而,单一的材料移植对于复杂的脊髓损伤效果有限。此外,在干细胞移植中,如何解决干细胞在损伤局部恶劣微环境中存活的问题,以及如何进行定向分化,这一系列的问题仍然有待解决。目的近年来,关于脊髓损伤修复的研究越来越达到共识,研究表明脊髓损伤的修复若想取得较好的结果,单一的干预方式效果有限。针对脊髓损伤的病理生理学基础,在不同的阶段进行对应的干预,可取得较好的效果。这些必要条件包括:(1)激发神经元内在的再生能力;(2)神经元轴突再生延伸所需要的支撑性底物;(3)进一步生长所需要的化学诱导因子;(4)术后康复训练。针对这一观点,我们试图利用聚己内酯(Poly-ε-caprolacton,PCL)作为轴突定向生长所需要的引物,并且体外验证PCL对PC12细胞生长的影响。利用成纤维细胞生长因子2(fibroblast growth factor 2,FGF2)和表皮生长因子(epidermal growth factor,EGF)诱导周围细胞分泌层粘连蛋白等支撑轴突生长所需要的底物。利用胶质细胞源性神经营养因子(glial-derived neurotrophic factor,GDNF)作为进一步化学诱导轴突生长所需要的化学诱导因子。水凝胶作为这些生长因子的载体,将富含这三类细胞因子的水凝胶均匀填充到聚己内酯(PCL)纳米纺丝周围,体外证实支架复合物的理化性质,而后将合成的支架复合物移植到横断性脊髓损伤大鼠的缺损部位,企图用于脊髓损伤的修复。方法1搭载神经营养因子的聚己内酯水凝胶纳米纺丝共聚物的制备及其理化性质研究1.1 PCL纳米纺丝的鉴定和PCL水凝胶理化特性研究:通过红外光谱和核磁光谱分析对PCL进行鉴定,通过扫描电镜对PCL水凝胶微观结构进行观察,采用全自动比表面及孔隙度分析仪BET对水凝胶比表面积、孔径大小进行检测,使用通用拉伸机对PCL水凝胶的压缩模量进行测定。1.2搭载神经营养因子聚己内酯水凝胶纳米纺丝共聚物的缓释特性研究:采用ELISA对支架复合物释放缓慢释放细胞因子的特性进行研究。2 PC12细胞和原代神经元分别与PCL纳米纺丝共培养:对PCL消毒灭菌处理后,将PCL固定细胞培养皿中,接种PC12细胞或者原代神经元,共培养后使用CCK-8法检测PCL对PC12细胞和原代神经元细胞的相容性。使用免疫荧光观察微管蛋白MAP2的表达情况,观察PCL对PC12细胞生长的影响,并对黏附定向生长的细胞进行计数。通过体外实验观察PCL纳米纺丝对神经细胞生长的影响,为体内的实验奠定基础。3支架复合物移植用于大鼠横断性脊髓损伤的修复研究:将30只220g左右的雌性SD大鼠随机分为脊髓损伤对照组(10只)、水凝胶/细胞因子组(10只)和PCL/水凝胶/细胞因子组(10只),采用显微手术技术完全横断大鼠T9脊髓组织,成功建立横断性脊髓损伤大鼠模型,分别将水凝胶/细胞因子和PCL/水凝胶/细胞因子移植到脊髓缺损部位。在术后1天,7天而后每周一次,持续8周使用BBB评分对各组大鼠后肢运动功能进行评估。在植入后2月,对大鼠进行灌注、取材和脊髓组织切片。对脊髓损伤部位的大体形态进行观察,使用HE染色观察损伤部位组织生长情况,采用免疫荧光染色观察损伤部位神经元(MAP2阳性细胞)轴突的再生情况,同时观察损伤部位层粘连蛋白底物的生长情况,进而探讨支架复合物对脊髓损伤的修复作用。结果1搭载神经营养因子聚己内酯水凝胶纳米纺丝共聚物的制备及其理化性质研究1.1通过红外光谱和核磁光谱分析对PCL进行