IDE基因在猪骨骼肌成肌细胞中的作用研究

作     者：郭健康 

作者单位：中国农业科学院 

学位级别：硕士

导师姓名：李奎

授予年度：2020年

学科分类：0905[农学-畜牧学] 09[农学] 

主      题：胰岛素降解酶 猪成肌细胞 增殖 分化 转录组 

摘      要：胰岛素降解酶(insulin-degrading enzyme,IDE)是一种在物种间高度保守的富含巯基的多功能锌金属蛋白酶。研究发现IDE能够特异性降解胰岛素和β淀粉样蛋白,因此与2型糖尿病和阿尔茨海默病有关,并被认为是2型糖尿病向阿尔茨海默病进展的桥梁。而骨骼肌组织是体内重要的胰岛素调控器官,且本团队最近的研究发现IDE可能与猪肌肉发育不良致站立困难有密切关系。因此我们研究了IDE基因在猪骨骼肌成肌细胞中的作用,以期了解IDE影响猪肌肉发育的分子机制。首先,我们利用小鼠C2C12成肌细胞系初步研究了Ide在成肌细胞增殖和分化中的作用及可能的分子机制。在C2C12细胞中转染Ide-siRNA后,qRT-PCR和Western-blot结果显示Ide表达显著下降。和对照组相比,在Ide-siRNA干扰48h后,CCK-8显示细胞活率显著升高,细胞周期相关蛋白Pcna、Cyclin B1和Cyclin A2表达显著升高,MyoD和MyoG表达显著下调,表明干扰Ide表达促进C2C12细胞增殖。同时发现,随着Ide表达下降,Bcl2表达显著升高,Bax表达显著下降,表明干扰Ide表达抑制C2C12细胞凋亡。在C2C12细胞分化的第1天和第5天检测Ide表达发现呈升高趋势,提示Ide可能参与调控C2C12细胞分化。在分化的第0天和第3天转染Ide-siRNA,结果发现和对照组相比,在分化后期(第5天)Ide-siRNA干扰组中MyoD和MyoG表达显著下调,分化标志基因Myhc表达显著下调,同时发现Akt2和磷酸化的AKT(P-AKT)表达下调。说明干扰Ide表达可能通过Akt2/P-AKT/MyoG通路抑制了C2C12细胞分化,为开展猪成肌细胞的相关研究奠定了基础。我们进一步研究了IDE在大白猪组织中的表达情况,及其在大白猪成肌细胞中的作用。qRT-PCR和Western-blot检测发现IDE在大白猪肾、肺、脾、肝、心、腓肠肌、背最长肌和股二头肌组织中广泛表达。CCK-8检测和细胞计数结果显示在大白猪成肌细胞中干扰IDE 24 h、48h和72 h后显著促进了细胞增殖。同时发现,和对照组相比,在IDE-siRNA干扰48h后,细胞周期相关蛋白PCNA、CCNA2、CCNB1、CCND1和CCNE2表达显著升高,MYOD和MYOG表达显著下调,说明干扰IDE表达同样促进了大白猪成肌细胞的增殖。但随着IDE表达下降,BCL2和BAX的表达没有显著变化,说明干扰IDE表达不会引起大白猪成肌细胞的凋亡。对IDE-siRNA和NC-siRNA(negative controlsiRNA)转染48h后的大白猪成肌细胞进行转录组测序分析,发现5194个差异表达基因,其中上调基因2658个,下调基因2536个。GO功能富集分析发现细胞组成有17条GO term显著富集,KEGG通路富集分析发现10条显著富集的通路,包括DNA复制、细胞周期、细胞衰老等。综上,我们的结果表明Ide对小鼠成肌细胞的增殖具有负调控作用,对分化则具有正调控作用;IDE在大白猪多种组织中广泛表达,对大白猪成肌细胞的增殖也具有负调控作用。转录组测序分析发现受IDE调控的差异基因和通路,为后续深入开展机制研究工作提供了信息。因此,本研究初步解析了IDE在骨骼肌细胞中的调控作用及可能的分子机制,为猪肌肉发育相关的基础研究和提高产肉性能的遗传改良提供了理论参考,也为猪的育种提供了候选分子标记。