GSK126通过EZH2-miR-26a-5p-NSD2轴调控弥漫大B细胞淋巴瘤生物学行为的研究

作     者：宁春萌 

作者单位：大理大学 

学位级别：硕士

导师姓名：潘云

授予年度：2019年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100214[医学-肿瘤学] 10[医学] 

主      题：弥漫大B细胞淋巴瘤 EZH2 NSD2 miR-26a-5p 

摘      要：研究背景淋巴瘤为全球常见肿瘤之一,近年来发病率呈显著上升的趋势,我国每年新增病例约为3%-5%。研究报道,自2005年以来的10年间,患者5年相对存活率增加不到5%。弥漫大B细胞淋巴瘤(diffuse large B-cell lymphoma,DLBCL)是最常见的非霍奇金淋巴瘤,占全球非霍奇金淋巴瘤的30%-40%。大多数DLBCL患者可以使用CD20单抗与化疗联合(R-CHOP)的一线化学免疫治疗方案达到治愈;然而,30%-40%的患者对一线治疗不敏感或出现耐药性复发,这表明DLBCL是一种异质性很强的疾病。随着二代测序技术的出现,人们对DLBCL的基因组特征有了新的认识。目前已经报道了许多驱动基因突变,并且其中部分已证实与患者预后密切相关,如EZH2、MYD88、NF-κB等。2017年版WHO淋巴组织肿瘤分类强调了各亚类的细胞分子生物学标记在诊断、治疗指导及预后判断中的作用,从而使得诊断更加趋于疾病本质。生物多样性的调控不仅仅在于DNA序列的改变,还可以通过表观遗传修饰进行。表观遗传改变指的是不改变DNA序列而改变表型或基因表达,包括DNA甲基化与组蛋白甲基化、乙酰化等共价修饰,以及染色质重塑、非编码RNA调控基因表达等非共价修饰。对染色质组蛋白尾部的修饰主要是通过许多不同氨基酸的乙酰化和甲基化发挥抑制或激活标记的功能。染色质的改变对于调节基因转录和表达至关重要,这些修饰性的改变可以在细胞分裂过程中进行复制,因此对维持细胞的正常生物学功能有重要作用。近年来全基因组测序发现几乎所有人类恶性肿瘤均有表观遗传失调。因此,充分了解肿瘤的表观遗传学异常改变和调控机制,并寻找干预表观遗传学修饰治疗肿瘤的策略,已成为肿瘤分子靶向治疗的研究热点之一。EZH2是一种组蛋白甲基转移酶(histone methyltransferase,HMTase),它是调节组蛋白N-末端氨基酸残基修饰的多梳抑制复合体2(PRC2)的重要组成部分,能够通过催化组蛋白H3K27me3影响组蛋白与DNA的亲和性,参与染色质重塑和基因表达调控。NSD2是一种含有核受体SET结构域的组蛋白甲基转移酶,其通过特异性催化组蛋白甲基化,发挥与转录活化相关的表观遗传标记的作用。有学者研究发现前列腺癌中高表达的EZH2能通过microRNA网络间接上调NSD2,发挥致瘤作用。我们前期研究工作发现EZH2和NSD2在B细胞淋巴瘤中高表达,且二者表达存在高度一致性,进一步验证DLBCL的miRNA表达谱发生了异常改变,提示microRNA网络可能在多种肿瘤中介导EZH2和NSD2的表达相关性。目前已有几种基于组蛋白甲基转移酶EZH2开发的抑制剂进入临床试验阶段,但仍然面临着推进速度缓慢等系列问题。EZH2基因的选择性抑制剂GSK2816126(GSK126)是一种含有2-吡啶酮基团的高选择性S-腺苷甲硫氨酸竞争性抑制剂,其能够通过在酶的结合口袋部位占据共底物SAM的位点来抑制酶活性。已有研究证实在DLBCL细胞系中GSK126能够显着抑制EZH2基因获得性突变的细胞增殖,并在小鼠模型中有效抑制异种移植瘤的生长,但GSK126对DLBCL细胞生物学行为的多因素影响和表观遗传调控机制尚不十分明确。综上,EZH2小分子抑制剂GSK126可能成为治疗DLBCL的一个潜在药物,在临床肿瘤治疗中具有应用前景。本研究提出一条“EZH2-miRNA-NSD2调控轴通路,拟研究GSK126对DLBCL细胞株生物学行为的影响,进一步探究EZH2-miRNA-NSD2调控轴在GSK126发挥抗肿瘤作用中的机制,为临床以分子靶向治疗角度攻克DLBCL提供新思路。研究目的1.探究GSK126对DLBCL细胞增殖、克隆形成、细胞周期分布和凋亡的影响。2.探究GSK126影响DLBCL细胞生物学行为的分子机制。3.探究EZH2通过抑制miRNA靶向调控NSD2影响细胞DNA损伤修复的机制。研究方法1.通过CCK8法检测细胞增殖能力变化。2.通过软琼脂克隆形成实验检测细胞克隆形成能力变化。3.通过Hoechst33258细胞核荧光染色、流式细胞术检测细胞凋亡情况。4.通过流式细胞术检测细胞周期分布变化。5.通过Western Blot方法检测EZH2、NSD2、相关组蛋白甲基化水平、DNA损伤标志和损伤修复蛋白表达变化。6.通过miRNA表达谱芯片分析DLBCL中差异表达的miRNA。7.通过Realtime PCR检测相关miRNA、目的基因mRNA表达情况。8.通过慢病毒介导瞬时转染EZH2 shRNA至293T细胞中,在RNA、蛋白水平验证相关分子表达变化情况。研究结果***126能够抑制DLBCL细胞增殖和克隆形成、诱导细胞凋亡、阻滞细胞周期于G0/G1期。随着药物浓度的增加,细胞增殖活性和