MicroRNA sponge沉默miR-148b对糖基化缺陷IgA1分子的影响

作     者：陈朝威 

作者单位：武汉大学 

学位级别：硕士

导师姓名：丁国华

授予年度：2017年

学科分类：1002[医学-临床医学] 10[医学] 

主      题：miR-148b sponge IgA1分子 糖基化缺陷 

摘      要：目的目前治疗IgA肾病的主要药物是糖皮质激素和免疫抑制剂等,但这些药物副作用大,疗效差。研究及开发能够精准治疗IgA肾病的新药是肾脏领域的研究热点之一。当前国内外学者对于IgA肾病研究发病机制研究,无论是GWAS还是非编码RNA的研究,都已经取得了许多重大进展。很多研究表明,IgA肾病的发病机制与机体的基因和非编码RNA的异常密切相关。然而目前临床使用的药物往往并非针对异常基因本身进行治疗,缺少靶向性和特异性。有研究发现IgA肾病患者外周血单个核细胞中miR-148b增高导致了糖基化异常IgA1分子的产生,沉默microRNA或可降低糖基化异常IgA1分子的产生。microRNA海绵(microRNA sponge)作为一种新的技术,可以稳定的沉默microRNA。基于此,本文通过构建腺病毒介导的microRNA sponge沉默miR-148b,研究该microRNA sponge是否可以用于改善IgA1分子的糖基化缺陷。方法通过miRbase数据库检索miR-148b成熟序列,根据该成熟序列设计对应的反义序列,并将反义序列上第9-12位碱基进行错配,合成一段含有4个重复反义序列的hsa-mir-148b-3p sponge序列,进一步将序列与pMIR载体连接,然后再将连接好的pMIR载体与pAD5/F35腺病毒载体共转染,转染后使hsa-mir148b-3p序列同源重组到腺病毒骨架载体上,最后筛选获得需要的阳性克隆腺病毒分子。体外培养产糖基化缺陷IgA1分子的DAKIKI细胞株,通过构建腺病毒miR-148b sponge感染细胞株,探讨其改善糖基化缺陷的机制。实验分为三组:空白对照组(control)、miR-148b scramble 组(control-GFP)、miR-148b sponge(miR-148b SP)组。分别用腺病毒miR-148b sponge转染24、48、72小时后,提取细胞内总RNA,通过RT-PCR检测miR-148b和C1GALT1基因表达。腺病毒转染72小时后,提取细胞总蛋白,免疫印迹法检测细胞C1GALT1蛋白表达。分别收集不同时间段细胞上清,酶联免疫吸附实验(ELISA)检测各组细胞上清中糖基化缺陷IgA1分子的含量。结果(1)腺病毒介导的海绵基因miR-148b被成功构建并鉴定;(2)将构建好的腺病毒miR-148b sponge用于转染DAKIKI细胞,通过荧光显微镜观察各组的转染效率,实验组可以检测到较高强度的绿色荧光,表明所构建的腺病毒具有较高的转染效率,可用于下一步实验研究。(3)实时荧光定量RT-PCR检测各组细胞中的miR-148b表达水平,结果显示相较于miR-148b scramble组,miR-148b sponge组细胞中miR-148b含量明显降低,同时C1GALT1基因表达水平明显增高。(4)免疫印迹法检测C1GALT1蛋白的表达水平,相较于miR-148bscramble组,miR-148bsponge组,C1GALT1蛋白表达水平表达增高。(5)通过酶联免疫吸附实验检测糖基化缺陷IgA1分子的表达水平,miR-148b sponge组糖基化缺陷IgA1表达水平明显组低于实验对照组。结论本研究成功构建了腺病毒miR-148b sponge,并验证了其可通过沉默miR-148b纠正IgA1分子的糖基化缺陷,为IgA肾病机制研究及其治疗提供新的思路。