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慢性乙型肝炎患者血清mir-21和mir-148b水平变化及其预测肝组织炎症分级和纤维化分期价值探讨

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实用肝脏病杂志 2022年第3期25卷 335-338页

作者：罗珂丁莉刘美湖北省荆门市第一人民医院病理科 448000 三峡大学第一临床医学院宜昌市中心人民医院检验科

目的探讨应用血清mir-21和mir-148b水平预测慢性乙型肝炎(CHb)患者肝组织病理学病变的价值。方法2016年7月~2021年6月我院诊治的CHb患者134例,行快速肝穿刺活检,评估肝组织炎症活动度分级(G)和肝纤维化分期(S)。采用实时定量逆转录PCR... 详细信息

目的探讨应用血清mir-21和mir-148b水平预测慢性乙型肝炎(CHb)患者肝组织病理学病变的价值。方法2016年7月~2021年6月我院诊治的CHb患者134例,行快速肝穿刺活检,评估肝组织炎症活动度分级(G)和肝纤维化分期(S)。采用实时定量逆转录PCR法检测血清mir-21和mir-148b水平。应用受试者工作特征曲线(ROC)下面积(AUC)评估血清mir-21和mir-148b水平评估CHb患者肝组织炎症分级和纤维化分期的效能。结果经肝组织检查,在134例CHb患者中,发现肝组织炎症活动度分级包括G1级23例、G2级39例、G3级47例和G4级25例,肝纤维化分期包括S1期31例、S2期46例、S3期28例和S4期29例;G1级、G2级、G3级和G4级血清mir-21水平分别为(1.1±0.2)、(1.5±0.3)、(1.8±0.4)和(2.2±0.6),血清mir-148b水平分别为(2.4±0.5)、(2.0±0.3)、(1.6±0.5)和(1.2±0.4),组间差异有统计学意义(Pmir-21水平分别为(0.9±0.4)、(1.4±0.3)、(1.9±0.5)和(2.7±0.5),血清mir-148b水平分别为(2.8±0.7)、(1.9±0.4)、(1.4±0.4)和(0.9±0.2),组间差异有统计学意义(Pmir-21=1.5和mir-148b=2.0为截断点,其联合评估肝组织炎症分级大于或等于G2的AUC为0.875,显著高于两项指标单独评估(分别为0.769和0.781,Pmir-21=1.4和mir-148b=1.9为截断点,其联合评估肝纤维化分期大于或等于S2的AUC为0.898,显著高于两项指标单独评估(分别为0.782和0.770,Pb患者血清mir-21高水平和mir-148b低水平的特点可以用于评估肝组织炎症分级和肝纤维化分期,值得深入研究。

关键词：慢性乙型肝炎肝组织病理学 mir-21 mir-148b 预测

SLE患者外周血单个核细胞中mir-148b、mir-152和靶基因dnmt1的表达及其临床意义

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免疫学杂志 2018年第11期34卷 966-971,983页

作者：杜明陶李王昱斌李春莳李光迪兰州大学第二医院检验中心 730030

目的探讨系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus,SLE)患者外周血单个核细胞中mir-148b、mir-152和其靶基因dnmt1的表达水平在发病机制中的作用以及与SLE实验室相关指标、临床疾病活动度的之间的关系。方法采用实时荧光定量PCR(qu... 详细信息

目的探讨系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus,SLE)患者外周血单个核细胞中mir-148b、mir-152和其靶基因dnmt1的表达水平在发病机制中的作用以及与SLE实验室相关指标、临床疾病活动度的之间的关系。方法采用实时荧光定量PCR(quantitative real-time,qPCR)方法检测74例SLE患者和44例健康者的PbMCs中mir-148b、mir-152、dnmt1的表达水平,统计学分析其与SLE疾病活动度及SLE相关检验指标的关系。结果 mir-148b、mir-152在SLE患者PbMCs中的表达水平显著高于健康对照(PbMCs中的表达水平显著低于健康对照(Pmir-148b在低活动组与健康对照组差异无统计学意义(P>0.05)外,mir-148b、mir-152和dnmt1在其他各组中的表达差异均有统计学意义。mir-152与ESR正相关(r=0.443,P=0.027);dnmt1与ANA抗体(r=-0.576,P=0.001)及SLEDAI评分均为负相关(r=-0.408,P=0.038)。结论 mir-148b、mir-152和dnmt1在SLE的发病机制中扮演着重要角色,可能作为疾病活动的参考指标,有助于指导疾病治疗和预后评估,并为SLE的治疗带来更多靶点。

关键词：系统性红斑狼疮 mir-148b mir-152 dnmt1

广西巴马小型猪mir-148b慢病毒制备及靶基因通路预测分析

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南方农业学报 2019年第7期50卷 1596-1604页

作者：张名媛郭晓萍孙晴超司景磊兰干球郭亚芬蒋钦杨广西医科大学实验动物中心南宁530021 广西大学动物科学技术学院南宁530004

【目的】构建广西巴马小型猪mir-148b慢病毒表达载体并对其靶基因进行预测及相关通路分析,为揭示mir-148b的作用机制打下基础。【方法】以广西巴马小型猪血液基因组DNA为模板,扩增mir-148b的前体及部分侧翼序列,使用T4连接酶将目的片段... 详细信息

【目的】构建广西巴马小型猪mir-148b慢病毒表达载体并对其靶基因进行预测及相关通路分析,为揭示mir-148b的作用机制打下基础。【方法】以广西巴马小型猪血液基因组DNA为模板,扩增mir-148b的前体及部分侧翼序列,使用T4连接酶将目的片段连接至pLV-CMV-MCS-EF1载体上,构建获得pLV-mir-148b慢病毒表达载体;以pLVmir-148b慢病毒表达载体转染293T细胞48 h后进行表达验证;利用mirDb、mirWalk 2.0和TargetScan 7.2三大数据库预测分析广西巴马小型猪mir-148b的靶基因,并以mirPath v.3分析mir-148b靶基因相关通路。【结果】广西巴马小型猪mir-148b片段大小为385 bp,与mirbase 21.0网站上已发布猪mir-148b成熟序列(前体和侧翼序列)的同源性达100%。构建获得的pLV-mir-148b慢病毒表达载体能在293T细胞中成功表达,且相对表达量极显著高于pLV-GFP慢病毒空载质粒转染组(Pmir-148b的靶基因,分别为CLOCK(时间昼夜调控因子)、MIER1(转录调控因子)、MECP2(甲基化CpG结合蛋白)、ZNF704(锌指蛋白)、SPTY2D1(SPT2染色质蛋白)、QKI(RNA结合蛋白)、ZbTb20(锌指蛋白)、MGAT4A(钠/磷酸转运蛋白)、UHMK1(编码蛋白激酶)、PIK3C2A(磷酸肌醇-3-激酶2α肽)、C6orf62(6号染色体开放阅读框62抗体)、HECW2(E3泛素蛋白连接酶)、MAP1b(微管相关蛋白)、NHS(NHS肌动蛋白调节因子)、b4GALT6(β-1,4-半乳糖基转移酶)、ATP2A2(肌浆ATP酶/内质网Ca2+转运酶)、AP4E1(蛋白复合物接头分子)和bbX(锌指蛋白);且发现有11条靶基因相关通路,其中与疾病相关的通路有脂肪酸合成通路、细胞外基质受体相互作用通路、癌症的蛋白聚糖通路、神经胶质瘤通路、癌症的小分子核糖核酸通路、肾细胞癌通路、N-聚糖生物合成通路和致心律失常性右室心肌病通路。【结论】广西巴马小型猪mir-148b慢病毒表达载体能在293T细胞中成功表达,mir-148b存在18个靶基因和11条相关通路,且主要在脂肪酸合成、N-聚糖生物合成及致心律失常性右室心肌病等相关疾病通路上发挥作用。

关键词：广西巴马小型猪 mir-148b 慢病毒载体靶基因相关通路预测

化疗药物通过下调mir-148b对乳腺癌细胞ER-α甲基化影响

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中华内分泌外科杂志 2019年第5期13卷 372-377页

作者：李泳澄孙丽马晓燕鹿存涛韩正祥曹苏生徐州医科大学临床学院徐州市中心医院肿瘤内科221009 解放军武汉总医院门诊部武汉430070 徐州医科大学临床学院徐州市中心医院乳腺外科221009 徐州医科大学附属医院肿瘤内科 221006

目的研究常用化疗药物对人乳腺癌细胞雌激素受体(estrogen receptor,ER)表达和甲基化的影响。方法采用剂量递增法,分别以紫杉醇(paclitaxel,PTX)和表柔比星(epirubicin,EPI)诱导>6个月,检测药物干预前后人乳腺癌细胞MCF-7(ER+,Luminal A... 详细信息

目的研究常用化疗药物对人乳腺癌细胞雌激素受体(estrogen receptor,ER)表达和甲基化的影响。方法采用剂量递增法,分别以紫杉醇(paclitaxel,PTX)和表柔比星(epirubicin,EPI)诱导>6个月,检测药物干预前后人乳腺癌细胞MCF-7(ER+,Luminal A)ER-α的表达和甲基化。用mirNA芯片筛选两种药物干预后MCF-7细胞中表达变化一致的mirNA,并以定量PCR(qPCR)验证。生物信息分析下调最显著的mirNA的靶点,将mirNA抑制剂(inhibitor)转染至MCF-7细胞,将mirNA模拟物(mimic)转染至MCF-7/PTX与MCF-7/EPI细胞,Western blot检测ER-α、DNA甲基转移酶1(DNA methyltransferase 1,DNMT1)的表达情况,定量甲基化特异性PCR(qMSP)检测ER-α甲基化。结果建立对PTX耐药的MCF-7/PTX细胞株,对EPI耐药的MCF-7/EPI细胞株。药物干预后,均引起ER-α蛋白表达下降、甲基化水平升高,伴随DNMT1和组蛋白去乙酰化酶1(histone deacetylase 1,HDAC1)的表达上调,筛选出药物干预后MCF-7细胞中表达变化一致的mirNA,并经qPCR验证,其中下调最显著的是mir-148b。经生物信息学分析,通过荧光素酶报告基因实验(Luciferas)证实DNMT1是mir-148b的直接靶点。mir-148b inhibitor引起MCF-7细胞中ER-α表达降低、甲基化水平升高及DNMT1的表达增高;mir-148b mimic引起MCF-7/PTX与MCF-7/EPI细胞中ER-α表达升高、甲基化水平降低及DNMT1的表达降低。结论化疗药物(以PTX和EPI为代表)诱导MCF-7细胞中mirNA表达紊乱,下调的mir-148b对DNMT1表达的抑制作用减弱,进而促使ER-α发生高甲基化,表达下调。

关键词：乳腺癌甲基化雌激素受体 mir-148b

LncRNA人浆细胞瘤变体易位1介导mir-148b调控脂多糖诱导巨噬细胞自噬的机制研究

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医学研究生学报 2021年第7期34卷 698-705页

作者：曹蔚堂王文欣青海红十字医院重症医学科西宁810000

目的目前LncRNA人浆细胞瘤变体易位1(LncRNA-PVT1)在脂多糖(LPS)诱导的巨噬细胞自噬的相关机制尚不清楚。文章旨在探讨LncRNA-PVT1介导mir-148b对LPS诱导的巨噬细胞自噬的相关机制。方法体外培养小鼠巨噬细胞株RAW264.7,LPS刺激并分别转... 详细信息

目的目前LncRNA人浆细胞瘤变体易位1(LncRNA-PVT1)在脂多糖(LPS)诱导的巨噬细胞自噬的相关机制尚不清楚。文章旨在探讨LncRNA-PVT1介导mir-148b对LPS诱导的巨噬细胞自噬的相关机制。方法体外培养小鼠巨噬细胞株RAW264.7,LPS刺激并分别转染PVT1 siRNA、mir-148b mimics、PVT1,分为LPS组(细胞不进行转染)、LPS+si-NC组(转染PVT1质粒阴性对照)、LPS+PVT1 siRNA转染组(转染PVT1 siRNA质粒)、LPS+mir-NC组(转染mir-148b mimics阴性对照)、LPS+mir-148b mimics组(转染mir-148b mimics)、LPS+PVT1-NC+mir-148b mimics组(转染PVT1阴性对照和mir-148b mimics)、LPS+PVT1+mir-148b mimics组(转染PVT1和mir-148b mimics)。同时设置空白组,空白组RAW264.7细胞既不进行LPS处理也不进行转染。采用qRT-PCR检测细胞中LncRNA-PVT1、mir-148b的表达;CCK-8检测细胞活力;免疫荧光染色检测细胞中LC3的表达;ELISA检测细胞中炎症因子水平;双荧光素酶报告系统分析PVT1与mir-148b的靶向关系;蛋白免疫印迹法检测细胞中自噬蛋白表达。结果与空白组比较,LPS组PVT1 mRNA、LC3阳性表达、LC3-II/LC3-I、beclin-1、TNF-α、IL-6水平显著升高(Pmir-148b、p62表达显著降低(Pmir-148b、LC3阳性表达、LC3-II/LC3-I、beclin-1表达显著升高(Pmir-148b存在靶向关系。与LPS组、LPS+mir-NC组比较,LPS+mir-148b mimics组LC3阳性表达、LC3-II/LC3-I、beclin-1表达显著上调(Pmir-148b mimics组、LPS+PVT1-NC+mir-148b mimics组比较,LPS+PVT1+mir-148b mimics组细胞LC3-II/LC3-I、beclin-1表达显著下调(Pmir-148b抑制巨噬细胞自噬,PVT1可能是脓毒症治疗的潜在研究靶点。

关键词：脓毒症 LncRNA人浆细胞瘤变体易位1 mir-148b 脂多糖巨噬细胞自噬

血清mir-21、mir-148b、mir-200a、mir-200b在原发性肝癌患者中的表达及临床诊断意义

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中国老年学杂志 2020年第5期40卷 951-955页

作者：程松郭婧澜西南医科大学附属医院检验科

目的研究原发性肝癌(HCC)患者血清中微小RNA(mir)-21、mir-148b、mir-200a、mir-200b的表达及临床诊断意义。方法应用实时荧光定量逆转录-聚合酶链反应(qRT-PCR)检测西南医科大学附属医院收治的93例HCC患者(病例组)、48例肝脏良性病变(... 详细信息

目的研究原发性肝癌(HCC)患者血清中微小RNA(mir)-21、mir-148b、mir-200a、mir-200b的表达及临床诊断意义。方法应用实时荧光定量逆转录-聚合酶链反应(qRT-PCR)检测西南医科大学附属医院收治的93例HCC患者(病例组)、48例肝脏良性病变(良性组)、48例慢性肝病患者(慢性肝病组)和50例健康体检者(对照组)血清中mir-21、mir-148b、mir-200a、mir-200b的表达。统计学分析各指标与临床病理特征之间的关系,受试者工作特征(ROC)曲线分析各指标的诊断价值。结果病例组血清mir-21与mir-200b表达显著高于良性组、慢性肝病组及对照组(均Pmir-200a与mir-148b表达显著低于良性组、慢性肝病组及对照组(均Pmir-21与mir-200b表达与病理分期、病理分级及肿瘤直径有关(均PbV)抗原是否阳性无关(均P>0.05)。血清mir-200a与mir-148b表达与病理分期、病理分级有关(均PbV抗原是否阳性无关(均P>0.05)。mir-21、mir-148b、mir-200a、mir-200b及四项指标联合的ROC曲线下面积(AUC)分别为0.821、0.668、0.772、0.734、0.922。联合诊断的敏感性和特异性均高于任一单一指标。结论HCC患者血清mir-21与mir-200b表达上调,而mir-200a与mir-148b表达下调。并且其表达与病理分期、病理分级有关,联合检测血清mir-21、mir-148b、mir-200a、mir-200b有希望成为新的诊断HCC的肿瘤标志物。

关键词： mir-21 mir-148b mir-200a mir-200b 原发性肝癌诊断

mir-148b通过下调Sirtuin7抑制黑色素瘤恶性生物学行为

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miR-148b通过下调Sirtuin7抑制黑色素瘤恶性生物学行为

作者：孙睿苏州大学

学位级别：硕士

【目的】:本研究将探究mir-148b对黑色素瘤恶性生物学行为的抑制作用及机制,为mir-148b成为黑色素瘤预后判断及治疗靶点奠定理论基础。【方法】:1、组织样本和细胞的准备,共收集黑色素瘤石蜡切片样本30例,皮肤良性肿瘤石蜡片8例。3个黑... 详细信息

【目的】:本研究将探究mir-148b对黑色素瘤恶性生物学行为的抑制作用及机制,为mir-148b成为黑色素瘤预后判断及治疗靶点奠定理论基础。【方法】:1、组织样本和细胞的准备,共收集黑色素瘤石蜡切片样本30例,皮肤良性肿瘤石蜡片8例。3个黑色素瘤细胞株,1株原代人黑色素细胞系。2、生物信息学分析研究,Target Scan预测mi R-148b的直接靶基因,SIRT7。3、利用实时荧光定量PCR技术,检测mir-148b在三株黑色素瘤细胞、人黑色素细胞的差异性表达。4、荧光原位杂交技术检测mir-148b在黑色素瘤组织及皮肤良性肿瘤组织石蜡切片中差异性表达。5、免疫荧光检测SIRT7在黑色素瘤组织及皮肤良性肿瘤组织中的表达差异及分布模式。6、SIRT7野生型及突变型质粒构建、mir-148b慢病毒包装和转染,mir-148b模拟物、抑制物及无义序列的合成。7、实时荧光定量PCR、免疫蛋白印迹法、双荧光素酶报告基因实验进行靶基因验证。8、观察mir-148b过表达后细胞表型的变化,即进行划痕、侵袭迁移、增殖及克隆形成细胞功能学实验。9、统计学分析。【结果】:1、实时荧光定量PCR实验证实mir-148b在黑色素瘤细胞的表达明显低于人表皮黑色细胞。2、荧光原位杂交结果证实mir-148b在黑色素瘤组织中表达水平显著低于皮肤良性肿组织。3、免疫荧光结果证实黑色素瘤组织中SIRT7染色强度明显高于皮肤良性肿瘤组织,主要分布于细胞核中,部分于胞浆中表达。4、双荧光素酶报告基因实验结果显示:mir-148b通过结合SIRT7基因的3’UTR区抑制SIRT7的表达,SIRT7是mir-148b的直接靶基因。5、Western blot结果显示mir-148b mimic的过表达能显著抑制SIRT7的蛋白水平表达。实时荧光定量PCR结果证实在mRNA水平上,转染mir-148b-mimic显著抑制了SIRT7的转录。6、侵袭、划痕、增殖及克隆形成实验证实mir-148b过表达能显著抑制黑色素瘤细胞侵袭、迁移、增殖及克隆形成能力。【结论】:1、实时荧光定量PCR结果证实mir-148b在黑色素瘤细胞的表达显著低于人表皮黑色素细胞。荧光原位杂交结果证实:与良性皮肤肿瘤相比,黑色素瘤组织中mir-148b表达水平明显下调。免疫荧光结果证实:与良性皮肤肿瘤组织相比,黑色素瘤组织中SIRT7表达水平明显上调。即mir-148b在黑色素瘤中扮演者抑癌因子的角色,可能与SIRT7在黑色素瘤中的表达负相关。2、SIRT7是mir-148b的直接靶基因,是肿瘤分子生物学机制研究的焦点之一,充分的实验证实mir-148b过表达能抑制SIRT7的表达水平,说明mir-148b可能通过调控SIRT7影响黑色素瘤的恶性生物学行为。3、mir-148b在黑色素瘤细胞中的稳定过表达能有效抑制其恶性生物学行为。过表达mir-148b能降低细胞的增殖、侵袭迁移及克隆形成能力。有望成为黑色素瘤基因治疗的有效分子。综上所述,SIRT7是mir-148b的直接靶基因,充分的实验证实mir-148b过表达能抑制SIRT7转录及翻译水平的表达既而抑制黑色素瘤恶性生物学行为,所以mir-148b及SIRT7有望作为黑色素瘤早期诊断、预后判断和分子治疗的新靶点。

关键词：黑色素瘤 mir-148b SIRT7 3’非翻译区

mir-148b调控线粒体分裂在高糖诱导的人肾小管上皮细胞损伤中的分子机制研究

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MiR-148b调控线粒体分裂在高糖诱导的人肾小管上皮细胞损伤中的分...

作者：杨莹中国医科大学

学位级别：硕士

目的:探讨高糖培养的人肾小管上皮细胞HK-2微小RNA-148b（mirNA-148b）对其靶基因AMPKα的表达变化,mirNA-148b表达变化对线粒体裂变蛋白DRP1及线粒体形态,线粒体内细胞色素c向胞质释放变化,细胞内活性氧（ROS）产生情况及细胞凋亡情况... 详细信息

目的:探讨高糖培养的人肾小管上皮细胞HK-2微小RNA-148b（mirNA-148b）对其靶基因AMPKα的表达变化,mirNA-148b表达变化对线粒体裂变蛋白DRP1及线粒体形态,线粒体内细胞色素c向胞质释放变化,细胞内活性氧（ROS）产生情况及细胞凋亡情况的影响,探讨高糖诱导肾小管损伤的发病机制,寻找新的治疗靶点.方法:体外培养人肾小管上皮细胞HK-2,细胞同步化后按如下分组:（1）分为正常糖组（5.5 mmol/L葡萄糖）、高糖组（30.0 mmo/L葡萄糖）继续观察培养48h后,采用RT-PCR方法检测两组细胞内mirNA-148b的表达变化。（2）转染mir-148b inhibitor抑制mir-148b表达。分为正常糖组、高糖组、阴性对照高糖组（转染阴性对照+30.0 mmo/L葡萄糖）和转染mir-148b inhibitor高糖组（转染mir-148b inhibitor+30.0 mmol/L葡萄糖）培养48h,采用MitoTracker荧光染料在共聚焦显微镜下检测线立体形态变化;采用DCFH-DA荧光探针荧光显微镜下观察各组细胞活性氧产生情况;western blot技术用于检测AMPKα蛋白、DRP1蛋白、Cytochrome c蛋白、cleaved-caspase3蛋白的表达变化;采用Annexin v/FITC荧光染料在流式细胞仪上检测细胞的凋亡情况。结果:（1）干预刺激肾小管上皮细胞48h,与正常糖组相比,高糖组mir-148b表达显著增高（p＜0.01）（2）干预刺激肾小管上皮细胞48h,与正常糖组相比,高糖组AMPKα蛋白的表达下调,抑制高糖状态下mir-148b的表达后,与高糖组相比,AMPKα的表达有所上调,（p＜0.05）但仍低于正常糖组。（3）干预刺激肾小管上皮细胞培养48h,与正常糖组相比,高糖组线粒体裂变相关蛋白DRP1表达增多（p＜0.05）,抑制高糖状态下mir-148b的表达后,与高糖组相比,线粒体裂变相关蛋白DRP1表达减少。（4）干预刺激肾小管上皮细胞培养48h,与正常糖组相比,高糖组细胞线粒体过度分裂,呈短棒状或点状,抑制高糖状态下mir-148b的表达后,线粒体的过度分裂被抑制,更多的恢复为线状和网状。（5）干预刺激肾小管上皮细胞48h,与正常糖组相比,高糖组细胞内ROS产生增多,细胞色素C向胞质中释放增多,抑制高糖状态下mir-148b的表达后,与高糖组相比,细胞内ROS产生较减少,细胞色素C向胞质的释放减少。（6）干预刺激肾小管上皮细胞48h,与正常糖组相比,高糖组肾小管上皮细胞凋亡相关蛋白cleaved-caspase3表达增加（p＜0.05）,凋亡率增高;抑制高糖状态下mir-148b的表达后,与高糖组相比,肾小管上皮细胞凋亡相关蛋白cleaved-caspase3表达减少,（p＜0.05）凋亡率减低（p＜0.05）,。结论:（1）体外高糖条件下培养的人上小管上皮细胞mirNA-148b表达与正常糖组相比显著上调。（2）高糖状态下肾小管上皮细胞mirNA-148b的过表达,下调靶蛋白AMPKα的表达,线粒体分裂相关蛋白DRP1上调,促进线粒体分裂,ROS过度产生,细胞色素C释放,细胞凋亡。转染mirNA-148b inhibitor后可以上调靶基因AMPKα的表达,抑制线粒体分裂,抑制高糖状态下肾小管上皮细胞氧化应激亢进和凋亡,发挥肾脏保护作用,是治疗糖尿病肾病新的潜在靶点。

关键词：糖尿病肾病肾小管上皮细胞线粒体分裂 mir-148b 氧化损伤凋亡

还原响应性纳米基因载体靶向递送mir-148b抑制HuH-7细胞转移侵袭的研究

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还原响应性纳米基因载体靶向递送miR-148b抑制HuH-7细胞转移侵袭...

作者：章志鸿福州大学

学位级别：硕士

肝细胞癌(HCC)是一种高死亡率的原发性肝癌,具有肝内转移的特性,可侵入门静脉及肝脏其他部位,导致术后复发,难以被彻底治愈。通过RNA干扰的方法可解决HCC转移和侵袭造成的肿瘤无法根治的难题,其中mir-148b是一种肝癌细胞转移侵袭的相关... 详细信息

肝细胞癌(HCC)是一种高死亡率的原发性肝癌,具有肝内转移的特性,可侵入门静脉及肝脏其他部位,导致术后复发,难以被彻底治愈。通过RNA干扰的方法可解决HCC转移和侵袭造成的肿瘤无法根治的难题,其中mir-148b是一种肝癌细胞转移侵袭的相关基因,在转移性的肝癌细胞中低表达,可对细胞癌的转移侵袭进行调控。但是游离的mir-148b静脉注射后易被血液中的血清核酸酶降解,且靶向性差,无法有效聚集在肿瘤部位。为了解决上述问题,本文以从主动靶向,高效递送的角度出发,以纳米基因载体为突破口,构建还原响应性纳米基因系统用于靶向递送mir-148b,并重点考察纳米体系的还原响应性、肿瘤靶向性、生物相容性、防细胞转移和侵袭性等。旨在为mir-148b提供一种可主动靶向肿瘤的、高效低毒的递送系统,以期解决肝细胞癌转移和侵袭难题。本文以毒性较小的低分子量支化聚乙烯亚胺(bPEI)为原料,通过二硫键(-S-S-)交联制备了具有高分子量和高转染率的阳离子载体SSbPEI,同时为了提高SSbPEI的生物相容性和肿瘤靶向性,引入聚乙二醇(PEG)和CC9肽制备出CC9-PEG-SSbPEI纳米载体。CC9-PEG-SSbPEI可通过正负电荷吸引作用与mir-148b有效结合,形成CC9-PEG-SSbPEI/mir-148b纳米粒;zeta电位分析和凝胶阻滞分析实验均证实CC9-PEG-SSbPEI能与mir-148b稳定结合,且能够保护mir-148b不被核酸酶所降解;DLS法测试该纳米粒的粒径,发现N/P比对纳米粒的粒径和分散度影响很大,当N/P=10:1时,粒径约为150 nm,纳米粒达到最佳状态;通过AFM和TEM图像发现纳米粒以球形均匀分散;此外,CC9-PEG-SSbPEI/mir-148b纳米粒具有还原响应性,可在GSH/DTT环境下降解并释放出mir-148b;通过流式细胞术及激光共聚焦显微镜观察发现,CC9-PEG-SSbPEI可促进Hu H-7细胞对mir-148b的摄取,证实该纳米体系对Hu H-7肝癌细胞具有靶向性;通过q RT-PCR分析法发现CC9-PEG-SSbPEI可提高mir-148b在Hu H-7细胞中的表达量,并有效地抑制了Hu H-7细胞中NRP-1基因的表达;划痕实验及Transwell迁移分析法研究发现CC9-PEG-SSbPEI/mir-148b能够有效抑制Hu H-7细胞的转移,侵袭及生长。更重要的是,CC9-PEG-SSbPEI/mir-148b的具有较低的溶血率(bPEI具有良好的细胞相容性。综上所述,本文所构建的CC9-PEG-SSbPEI/mir-148b的纳米基因递送系统可有效解决mir-148b递送过程出现的易降解、靶向性差等问题,有望为肝细胞癌基因调控疗法提供潜在的基因递送载体。

关键词：肝细胞癌 mir-148b 纳米基因载体还原响应性靶向递送