人核心聚糖蛋白真核表达系统构建及其活性评价

作     者：马炳南 

作者单位：辽宁大学 

学位级别：硕士

导师姓名：毕秀丽

授予年度：2014年

学科分类：1001[医学-基础医学(可授医学、理学学位)] 10[医学] 

主      题：核心聚糖蛋白(DCN) 真核表达 蛋白分离纯化 MTT 结肠癌肿瘤细胞 

摘      要：核心聚糖蛋白(Decorin)存在于细胞外基质中,含有大量亮氨酸,1978年由美国国立卫生研究院骨科研究所的Fisher教授首次分离,其分子量为39KD,具有多种重要的生物活性。核心聚糖蛋白通过与细胞外基质蛋白、细胞因子、细胞表面受体相互作用,可以抑制肿瘤细胞的发生、发展和生长。早期研究发现,Decorin的缺失会促进肿瘤的发生。研究发现,DCN能与TGF-β结合,DCN竞争性地和TGF-β结合,使TGF-β的生物活性受到抑制,并且能够影响TGF-β结构的稳定性。核心聚糖蛋白还能和EGFR结合,可使EGFR/ErbB的受体酪氨酸激酶表达受到抑制,这种抑制是由于EGFR酪氨酸激酶的持续丧失活性造成的,这种抑制还会导致细胞内钙离子增加,p21,p27(细胞周期调节蛋白依赖性激酶抑制剂)基因被诱导开放,p21,p27蛋白上调,最终引起肿瘤生长抑制。也有研究发现,DCN是Met受体的一个竞争型配体,它可以跟Met受体结合,诱导其表达从而引发其泛素化进而被降解,同时引起其下游效应分子之一的p-catenin的显著降解下调。最新研究发现Decorin可能通过诱导不同的EGFR反应,有选择性的激活受体自身磷酸化区域的磷酸酪氨酸来产生与EGF不同的信号连锁反应,并通过自身降解来抑制ErbB2和ErbB4受体的活性,最终达到抑制肿瘤细胞增殖的目的;Decorin也会通过诱导内皮细胞形成及激活细胞内途径来影响肿瘤血管生成;同时,Decorin在体外、体内和异种移植模型条件下均参与同E-cadherin结合的因子p-catenin的下调活动,所以有理由认为Decorin在肿瘤转移过程中发挥着重要作用。在前期研究基础上,本研究利用基因工程技术,制备Decorin的真核细胞(毕赤酵母)蛋白表达系统。经G-75分子筛纯化蛋白,利用划痕愈合实验和MTT法确定其抑制肿瘤细胞生长及迁移的活性,以Western Blot研究Decorin蛋白抑制肿瘤细胞生长的分子机制,研究结果如下:1)表达载体构建:通过PCR得到Decorin基因,将其与pPICZαA酵母表达质粒连接构建真核表达载体pPICZαA-decorin,将得到的载体转化大肠杆菌DH5α,经酶切和测序确认得到表达载体pPICZαA-decorin。将pPICZαA-decorin线性化后电转化进入毕赤酵母X-33中与酵母基因整合,完成Decorin酵母表达载体的构建。2)重组蛋白诱导表达和纯化:将重组质粒大量提取后线性化,通过电转化方法使其与毕赤酵母基因整合,将转化后的酵母接种到含博来霉素(Zeocin)和山梨醇的YPD固体培养基上30℃培养3～5天,当长出菌落时,将每个菌落接种到含高浓度博来霉素(Zeocin)的YPD固体培养基上30℃培养3～5天,直到长出单菌落。挑选生长良好的单菌落接种到20ml YPD液体培养基中37℃摇床过夜培养,第二天按3%接种于100ml YPD液体培养基中37℃摇床培养,直到OD600≈ 1.0时加入0.5%甲醇诱导重组蛋白表达,每隔24小时补加一次甲醇,4天后收集培养基1O000rpm离心15min收集上清液,过G-75分子筛,经洗脱、浓缩除盐和冷冻干燥,得到重组蛋白。3)生物学活性分析:以细胞划痕愈合实验和MTT法分析重组蛋白在体外抑制肿瘤细胞生长与迁移的活性。结果表明,所得到重组蛋白具有抑制结肠癌细胞生长于迁移的活性。4)分子机制研究:以Westem Blot检测蛋白表达量变化,通过实验结果发现真核表达的重组Decorin蛋白下调了CDK4、Cyclin D1和β-catenin表达水平,上调了 E-cadherin表达水平。综上所述,本研究所构建重组蛋白具有抑制结肠癌肿瘤细胞生长及迁移的作用,并且通过毕赤酵母表达重组蛋白能对Decorin基因的表达产物进行正确的折叠和翻译后加工修饰,使表达产物更接近于目的蛋白的天然结构,有效保持了其生物学活性。同时,本研究将为研制新型结肠癌治疗药物奠定良好的基础。