牛支原体P81蛋白原核表达及亚单位疫苗的研制

作     者：张新竹 

作者单位：内蒙古农业大学 

学位级别：硕士

导师姓名：郝永清

授予年度：2019年

学科分类：090603[农学-临床兽医学] 09[农学] 0906[农学-兽医学] 

主      题：牛支原体 原核表达 间接ELISA 动物试验 

摘      要：牛支原体(ycoplasma bovis)是一种引起牛呼吸道疾病的病原体,隶属于柔膜体纲,支原体目,支原体属,没有细胞壁,大小为0.2～0.3 μm。牛支原体1961年美国首次从患乳腺炎的乳汁中分离出来。1976年发现牛支原体与呼吸系统疾病密切相关。2008年国内首次分离出牛支原体。牛支原体可以引起多种疾病,成为阻碍养牛业发展的一大重要隐患。此病在全国范围内逐步蔓延,给我国的养牛业造成了极大的经济损失。因此,疫苗的研发成为当前重要的任务。纤维素具有无限延伸的能力,可以通过将纤维素分别与多个特异性蛋白质相连接,并且防止其在自组装或在表达过程中聚集,随后在特定时间和地点诱导他们共同组装。纤维素作为新型的免疫佐剂,具有良好的免疫增强作用,其特有的延伸功能为多联疫苗的研制提供新的可能。本试验首先选取牛支原体特异性蛋白P48蛋白及P81蛋白。通过对牛支原体16SrRNA、P48、P81基因进行扩增,通过测序结果进行进化树分析,证明牛支原体P48、P81具有高度保守性。随后,运用overlapPCR方法将P81基因序列中的TGA突变为其同义密码子TGG,再与纤维素连接,通过原核表达方法表达P81重组蛋白;将纯化后的PCR产物与pET-32(+)分别双酶切后,进行连接,将连接后产物转化至Trans-Tl感受态细胞中,提取质粒后,转入BL31(DE3)感受态细胞中表达P81蛋白。通过Westem-blottin验证,P81蛋白具有良好的反应原性。并通过建立P81间接ELISA方法证明P81具有良好的特异性、敏感性;通过动物实验证明该蛋白作为亚单位疫苗对动物机体产生良好的保护,抵抗牛支原体的入侵,且产生高水平抗体效价,21天时抗体滴度达到212。