可注射水凝胶负载外泌体促进脂肪干细胞成骨能力的研究

作     者：陈义庆 

作者单位：中国医科大学 

学位级别：硕士

导师姓名：郭澍

授予年度：2019年

学科分类：08[工学] 080501[工学-材料物理与化学] 0805[工学-材料科学与工程（可授工学、理学学位）] 080502[工学-材料学] 

主      题：脂肪干细胞 外泌体 壳聚糖水凝胶 成骨能力 骨组织工程 

摘      要：目的:外泌体(exosomes)是一种具有细胞间通讯功能的纳米级细胞囊泡,在各种生理或病理活动中起着关键作用,如免疫调节、肿瘤发生、血管生成和组织愈合等。水凝胶(hydrogel)在水溶液中膨胀形成三维交联网状结构,提供与细胞外基质相似的适宜微环境,以促进向成骨细胞迁移、粘附、增殖和分化,且有效的传递营养物质和生长因子,水凝胶负载细胞的发展为细胞治疗开辟了新的可能性。本研究通过设置对照,探究来自人类脂肪干细胞(adipose-derived stem cells,ADSCs)诱导所产生的外泌体在可注射温敏型含有壳聚糖,纳米羟基磷灰石,胶原和β-甘油磷酸钠(CS/nHAC/β-GP)的水凝胶的成骨表达能力的作用研究。研究方法:1、提取人的ADSCs体外进行培养及及鉴定。2、ADSCs成骨诱导所产生的外泌体(ADSCs-Exo)的提取及鉴定。3、制备可注射温敏型含壳聚糖,纳米羟基磷灰石,胶原和β-甘油磷酸钠(CS/nHAC/β-GP)的水凝胶。4、通过设置对照实验,实现ADSCs-Exo,ADSCs,水凝胶的共培养。5、通过SEM观察、ALP、矿化结节等指标验证来自ADSCs成骨诱导产生的外泌体的加入,能够显著提高ADSCs在水凝胶上成骨能力的表达。结果:1、透射电镜可观察到ADSCs-Exo的形态,散在分布,呈现低密度电子颗粒,直径介于30-130nm之间。Western blot检测分析,提示特异性蛋白CD9、CD63的表达量较为明显,证实所提取的是ADSCs-Exo。2、扫描电镜可见水凝胶为三维多孔结构,孔径从数10μm到近300μm不等,孔与孔之间相连通,可见散在分布的ADSCs。3、在体外实验中,与对照组相比,外泌体组的ALP表达显著升高。4、第21天,对照组的细胞不能被茜素红染色;含有ADSCs-Exo的实验组,细胞间质可见明显的钙结节,可被茜素红染为橙红色。5、外泌体对ADSCs在CS/nHAC/β-GP水凝胶内的增殖有明显促进作用,外泌体对其成骨能力的表达有明显促进作用。结论:我们由ADSCs产生的外泌体和CS/nHAC/β-GP水凝胶实现三维共培养,该水凝胶提供了理想的微环境,而外泌体的加入,能显著提高水凝胶上的ADSCs的成骨能力的表达。