CrgA调控假单胞菌SJTD-1中长链烷烃降解的分子机制研究

作     者：纪南南 

作者单位：上海交通大学 

学位级别：硕士

导师姓名：刘建华

授予年度：2018年

学科分类：083002[工学-环境工程] 0830[工学-环境科学与工程（可授工学、理学、农学学位）] 07[理学] 08[工学] 09[农学] 0903[农学-农业资源与环境] 0713[理学-生态学] 

主      题：铜绿假单胞菌SJTD-1 烷烃羟化酶 烷烃降解 转录调控 CrgA 

摘      要：微生物修复的方法被认为是解决石油污染的一种有效绿色又节能的手段。截至目前,已有多种石油降解菌株、石油降解的途径及相关酶系被分离鉴定出来,降解相关的调控已有部分推进。然而,中长链烷烃降解作为其中的研究难点,其调控机制依然不明确。本课题组前期分离出了一株可以高效降解长度为C12-C32的烷烃类物质的铜绿假单胞菌株SJTD-1,通过对其全基因组测序及注释,蛋白质组学分析等方式我们筛选出了一些潜在的与烷烃降解代谢相关的基因P450、P450、alkB1、alkB2、almA1、almA2、ladA1、ladA2等,且alkB2基因已被证实参与了SJTD-1中的中长链烷烃降解。通过Pull-Down实验我们筛选出了若干个包括预测为CrgA在内的可能参与到SJTD-1菌株烷烃降解代谢的转录调控因子。本工作由体外和体内两方面着手,体外通过CrgA蛋白异源表达、凝胶阻滞实验、Footprinting实验、解离试验,体内通过敲除实验、生长曲线测定、RT-qPCR、荧光表达实验,探究了转录调控因子CrgA对筛选出的几个中长链烷烃降解基因尤其是alkB2基因的调控作用。通过多序列比对、进化树分析与三级结构的模拟,铜绿假单胞菌株SJTD-1中预测为CrgA的蛋白与脑膜炎奈瑟氏菌中的CrgA具有较高的同源性和序列相似性,故将其归为LysR家族CrgA亚家族;凝胶阻滞实验显示CrgA蛋白与alkB2、almA2、ladA1、ladA2基因以及自身编码基因crgA上游启动子区均有特异性的结合;Footprinting实验显示CrgA蛋白与alkB2基因上游启动子区有两个镜像结构即反向对称结构(IIR)的结合区,分别为:5’-CCCTTGGCCGGC/CTGCCCCATCCC-3’和5’-TCGTTCTGT/CCGCCGCT-3’。且将该结构截断一半破坏其反向对称的结构后,与CrgA蛋白的结合水平大大减弱。这一现象表明该结构是对两者结合的关键结构;烷烃的中间代谢产物,十六酰-CoA与十八酰-CoA对CrgA蛋白与alkB2基因上游启动子区的结合具有解除效应,而乙酰辅酶A等其他效应物对其不具有显著的解除效应。生长实验显示crgA基因的敲除使得菌株在烷烃为碳源生长时的生长速率加快;RT-qPCR实验显示SJTD-1与crgA单敲除菌株S1ΔcrgA在葡萄糖和不同中长链烷烃(C12-C24)中培养时,相较于在葡萄糖中培养,alkB2基因的转录表达水平显著升高。敲除crgA基因后,在烷烃存在条件下,S1ΔcrgA中alkB2基因的转录表达水平较高。almA2、ladA1、ladA2基因也显示了同样的现象;荧光表达实验显示,带有alkB2启动子的报告质粒在S1ΔcrgA菌株荧光蛋白的表达高于带有相同质粒的野生型SJTD-1菌株。且在烷烃存在时相较于葡萄糖为唯一碳源,绿色荧光蛋白的表达水平更高。综上可知,CrgA可以通过抑制alkB2的转录来参与菌株SJTD-1的烷烃降解调控过程。且CrgA蛋白也可能参与了almA2、ladA1、ladA2等几个长链烷烃羟化酶编码基因的转录调控。本研究进一步推进了烷烃降解的分子调控机制研究,为后续对高效可应用菌株的改造提供可靠的理论支持。