miR-155-5p靶向IKBKE在THP-1细胞抗新生隐球菌免疫反应中的机制研究

作     者：王一霖 

作者单位：中国人民解放军海军军医大学 

学位级别：硕士

导师姓名：陈江汉

授予年度：2019年

学科分类：1001[医学-基础医学(可授医学、理学学位)] 100102[医学-免疫学] 10[医学] 

主      题：新生隐球菌 THP-1细胞 miR-155-5p IKBKE 免疫反应 

摘      要：新生隐球菌是一种环境致病菌,可以感染人类和许多哺乳动物的肺部、皮肤黏膜、肝脏、骨骼等全身器官,但最常侵犯中枢神经系统,引起具有致死性威胁的隐球菌性脑膜炎。据估计,仅2014年就新增223100隐球菌性脑膜炎病例,其中73%发生在非洲[1]。与欧美、非洲等地区隐球菌性脑膜炎主要发生在AIDS人群不同的是,我国主要发生无已知免疫功能缺陷看似免疫功能正常的人群,但该人群相比免疫功能缺陷的病人治疗周期更长,更困难,给病人和社会带来的经济负担更重[2]。隐球菌性脑膜炎患者如不及时治疗,86%的人在一年内死亡,即使现代充分治疗的情况下,死亡率仍有20%-30%左右[3]。因此,如何有效防治新生隐球菌中枢神经系统感染,是我们目前急需解决的问题。THP-1细胞(人单核巨噬细胞)是人体固有免疫系统的重要组成部分,在外界因素刺激下可被激活为经典激活巨噬细胞(M1型)和替代激活巨噬细胞(M2型):M1型细胞分泌肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-6(IL-6)等炎症因子,具有很强的杀菌作用;M2型巨噬细胞分泌转化生长因子-β(TGF-β)、精氨酸酶1(Arg1)、白细胞介素-10(IL-10)等炎症因子,可抑制炎症反应[4]。在新生隐球菌性脑膜炎患者中,M1型细胞有助于清除病原体,而M2型细胞介导免疫逃逸[5],因此促进THP-1细胞向M1型极化有助于治疗隐球菌性脑膜炎。Micro RNA(miRNA)是一类长度约为20～24 nt非编码小RNA分子,主要在转录后水平调节靶基因表达,参与细胞分化、信号转导、免疫应答、肿瘤发生等多种生命活动。miR-155-5p位于人类21号染色体上B-cell Integration Cluster(bic)基因的第三个外显子内,可通过靶向降解目的基因m RNA发挥其功能作用。有研究发现其在人肺癌、甲状腺癌、宫颈癌、胰腺癌等实体瘤中高表达,与肿瘤细胞的增殖分化相关[6];另有研究表明miR-155-5p参与免疫细胞的发育分化,在活化的巨噬细胞、T淋巴细胞、B淋巴细胞和树突状细胞中表达明显增加,并在免疫应答中发挥着重要的作用[7]。IKBKE是一种编码丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶的基因,是IκB激酶家族(IKKs)家族新近发现的成员,可参与肿瘤发生发展和免疫细胞的活化、增殖、分化及凋亡[8]。有研究发现其可通过调节核转录因子-κB(NF-κB)信号转导途径,在固有免疫系统中发挥重要作用[9]。通过前期mirnada网站预测,我们发现miR-155-5p和IKBKE基因有结合位点,而miR-155-5p和IKBKE基因均参与细胞炎症反应,因此我们猜测miR-155-5p通过靶向降解IKBKE m RNA在THP-1细胞抗新生隐球菌免疫反应中发挥着作用。一、新生隐球菌诱导THP-1细胞后miR155-5p、IKBKE、TNF-α、IL-1β和IL-6的表达变化更换细胞液,调整好THP-1细胞的生长状态,加入PMA将细胞分化为巨噬细胞,用灭活的新生隐球菌按照数量5:1加入细胞培养瓶中,分别干预0h、3h、6h、9h、12h,取各自时间点的上清和细胞,保存于-80℃冰箱。将上清解冻,用酶联免疫吸附法(Elisa)测定上清中TNF-α、IL-1β和IL-6的含量;用Trizol法提取细胞RNA,用实时荧光定量聚合酶链反应(q PCR)测定miR155-5p和IKBKE的表达倍数变化。我们研究发现在新生隐球菌干预下,THP-1细胞中miR-155-5p表达增加,其中在6h达到峰值,IKBKE含量降低,在3h、6h、9h有统计学差异,TNF-α、IL-1β和IL-6的表达量随时间明显增加。二、双荧光素酶报告系统验证miR-155-5p和IKBKE的靶向关系根据mirnada网站预测结果,miR-155-5p可靶向降解IKBKE m RNA,为了进一步验证该靶向关系,我们进行了双荧光素酶报告实验:将实验分为6组,分别是海肾荧光素酶(p RL)质粒+mimics NC、p RL质粒+miR-155-5p、p RL质粒+IKBKE 3 UTR+mimics NC、p RL质粒+IKBKE 3 UTR+miR-155-5p、p RL质粒+IKBKE 3 UTRmut+mimics NC、p RL质粒+IKBKE 3 UTR-mut+mimics NC。将生长良好的细胞分入24-well培养板培养,根据分组转染质粒。24h后使用荧光显微镜观察目的荧光标记基因的表达情况,然后使用“Dual-Luciferase?Reporter Assay System(E1910,promega)试剂盒处理细胞、进行荧光素酶表达检测。我们研究发现实验组较对照组荧光值降低了30%,表明miR-155-5p可靶向降解IKBK