CREB3L4基因异常表达影响非小细胞肺癌发生发展的初步探讨

作     者：何晨晖 

作者单位：昆明医科大学 

学位级别：硕士

导师姓名：张艳亮

授予年度：2019年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100214[医学-肿瘤学] 10[医学] 

主      题：宣威肺癌 CREB3L4 慢病毒 稳定转染 动物模型 

摘      要：[目 的]肺癌是人类健康和生命疾病的严重威胁。在我国,肺癌发病率和死亡率迅速上升,并已成为我国发病率和死亡率较高的恶性肿瘤。云南宣威是一个吸引全球疾病研究人员关注的地区,因为宣威是全国不吸烟者中肺癌发病率最高的地区,女性肺癌死亡率位于全国首位。因此,筛选出宣威肺癌潜在的分子标志物,进一步探寻云南宣威肺癌发生发展的机制,寻找新的诊断和治疗的靶点。本课题的前期研究发现,CREB3L4基因在云南宣威肺癌患者的癌组织中的表达明显高于癌旁组织,并与TNM分期及淋巴结转移相关,提示CREB3L4基因可能在云南宣威肺癌发生发展中起重要作用,并且可能是宣威肺癌中潜在的致癌基因。前期研究应用云南宣威肺癌细胞JT及人肺腺癌细胞A549细胞模型,在体外实验中观察CREB3L4上调、下调对宣威肺癌细胞株及人肺腺癌细胞株生物学行为的影响,发现CREB3L4基因是促进肺癌细胞发生发展的。本研究旨在构建动物模型,通过对肿瘤生长、转移等检测,在体内水平研究CREB3L4的改变对于肺癌发生发展的影响。[方法]1、将构建成功并且测序序列正确的质粒进行转染,慢病毒包装,并收获慢病毒及浓缩。利用RT-qPCR测定慢病毒滴度。将收集的过表达及其对照、干扰组及其对照的慢病毒浓缩液稳定转染入云南宣威肺癌细胞株JT中,筛选稳定感染细胞株及其相应的对照细胞株,采用Western Blot进行CREB3L4蛋白含量测定,通过细胞划痕实验检测过表达组及干扰组细胞的迁移能力。2、大批培养云南宣威肺癌细胞JT,注射裸鼠、SCID小鼠及B-NDG小鼠皮下,构建动物模型。大批培养人肺腺癌细胞A549,注射裸鼠皮下,构建动物模型,注射细胞后10天,每隔三天测量肿瘤的体积,待肿瘤生长至28天后取出皮下移植瘤组织及肺组织,进行HE染色及CREB3L4抗体的免疫荧光检测。再大批培养A549细胞进行裸鼠皮下成瘤,注射细胞20天后,隔天向肿瘤组织中注射过表达、干扰慢病毒,及其相应对照慢病毒,注射慢病毒后一天测量注射相应慢病毒后肿瘤体积,连续注射5次慢病毒后,取出皮下移植瘤及小鼠肺组织,RT-qPCR测定注射慢病毒后,小鼠皮下移植瘤相应CREB3L4的mRNA表达情况。通过HE染色观察小鼠皮下移植瘤组织及肺组织病理改变情况。免疫荧光观察肿瘤组织块及肺组织CREB3L4蛋白的表达量及定位。[结 果]1、通过Western Blot检测稳定转染慢病毒的过表达及其对照,干扰组及其对照的CREB3L4蛋白表达情况,结果表明过表达及其对照,干扰组及其对照的稳定转染细胞株构建成功,证明包装的慢病毒具有很明显的生物学作用。细胞划痕实验,CREB3L4过表达与对照组相比,48h后其宽度明显减小,提示过表达CREB3L4基因可能促进肿瘤的发生发展。根据稳定转染的过表达组及干扰组Western Blot检测CREB3L4蛋白表达情况,siCREB3L4-32的干扰效率要明显高于siCREB3L4-31,所以选择siCREB3L4-32进行迁移能力检测及后续的动物实验。48h后siCREB3L4-32的划痕区域的宽度稍宽于对照组,有一定的差异,提示敲减CREB3L4可能抑制肿瘤的发生发展。2、大批培养JT宣威肺癌细胞分别注射进入裸鼠、SCID小鼠、B-NDG小鼠中,肿瘤成长情况基本一致,在注射肺癌细胞10天之内,瘤体逐渐长大,但随着时间增加,肿瘤逐渐缩小直至消失。大批培养人肺腺癌细胞A549注射进入裸鼠皮下,7天左右可触及明显的瘤体,肿瘤组织随着时间的增加逐渐增大,A549动物模型构建成功;待注射细胞28天后取出肿瘤组织及肺组织,进行HE染色及CREB3L4抗体的免疫荧光检测:注射A549细胞后裸鼠的皮下移植瘤HE染色发现有明显的癌细胞浸润,建模成功的裸鼠肺组织HE染色与正常裸鼠肺组织HE染色结果相比较,有明显的病理学改变,肺泡间距更宽,有肿瘤细胞浸润;裸鼠皮下移植瘤CREB3L4免疫荧光检测,发现CREB3L4定位于细胞质,与以前的研究一致。大量培养A549细胞皮下注射裸鼠20天后,向皮下瘤体分别注射过表达及其对照、干扰及其对照慢病毒,每隔一天注射一次,连续注射5次,每次注射后第二天测量肿瘤体积,然后取出肿瘤组织进行HE染色及CREB3L4抗体的免疫荧光检测以及RT-qPCR CREB3L4 mRNA表达量的测定。RT-qPCR结果显示过表达组其CREB3L4表达量显著增高,干扰组CREB3L4表达量下降,结果显示有差异。注射过表达、干扰及其对照的慢病毒后,HE染色发现肿瘤组织及小鼠肺组织的病理改变与注射A549后小鼠肿瘤组织及肺组织的病理改变没有差别。免疫荧光结果显示,虽然注射相应慢病毒后,小鼠肺组织的CREB3L4的表达量的改变没有明显差异,但是小鼠皮下移植瘤的CREB3L4的表达量有明显的对应的改变。[结 论]CREB3L4基因有利于肺癌细胞的发生发展。在裸鼠皮下移植瘤组织水平验证,发现CREB3L4定位于细胞质,于以前的研究一致。裸鼠皮下移植瘤组织内可以稳定表达外源的CREB3L4基因,CREB3L4有一定的促进肿瘤发生发展的趋势。本研究为进一步构建动物模型,在体内水平探讨CREB3L4基因表达改变对非小细胞肺癌发生发展中的生物学作用奠定了一定的基础。