基于群体感应研究香芹酚对鱼源荧光假单胞菌单/混生物被膜的抑制作用

作     者：王雅莹 

作者单位：浙江工商大学 

学位级别：硕士

导师姓名：朱军莉

授予年度：2020年

学科分类：08[工学] 082203[工学-发酵工程] 0822[工学-轻工技术与工程] 

主      题：生物被膜 荧光假单胞菌 香芹酚 群体感应 LuxR 金黄色葡萄球菌 

摘      要：群体感应(Quorum sensing,QS)是一种细胞间交流机制,能调控生物被膜、腐败酶和毒力因子分泌等。生物被膜是细菌的结构化群落,细菌粘附于其表面并嵌入细胞外聚合物质的自身基质中,由于生物被膜对抗菌剂具有很高的抵抗力,引起一系列食品加工行业的潜在安全性问题。荧光假单胞菌是重要嗜冷腐败菌和强生物被膜生成菌株,而金黄色葡萄球菌是国内水产品中常见的条件致病菌,其生物被膜也引起关注。植物精油(Essential oils,EOs)具有抗微生物、抗病毒、抗氧化等功能,常被用作食品防腐剂以控制食物腐败和食源性致病细菌。本研究以冷藏大黄鱼中分离的致腐荧光假单胞菌、杀鲑气单胞菌和金黄色葡萄球菌(金葡菌)为研究对象,从10种精油物质肉桂醛和香芹酚的结构类似物中筛选得到抑菌和抗生物被膜能力效果最好的香芹酚;以群体感应为切入点,比较香芹酚对荧光假单胞菌野生株和LuxI缺失株的抗生物被膜能力及酰基高丝氨酸内酯(AHLs)活性的差异变化,分子对接和转录组学测序探究香芹酚对荧光假单胞菌的差异表达基因和代谢通路影响;进一步研究荧光假单胞菌和金葡菌在鱼汁基质中共培养的互作,探讨混合生物被膜对香芹酚的抗性作用。研究为食源性微生物多菌种间生物被膜作用机制提供理论支持,为植物精油在水产品保鲜加工中微生物的控制应用提供技术基础。主要结果如下:1、研究发现10种香芹酚和肉桂醛结构类似物都能显著的抑制荧光假单胞菌、杀鲑气单胞菌和金黄色葡萄球菌生长和生物被膜形成。EOs的结构特征影响其抗菌活性,其中香芹酚类似物抑菌活性高于肉桂醛类似物,与苯环上的醛基、羟基和苯环有关。在亚抑菌浓度下EOs均能显著抑制三种菌株的生物被膜、多糖产生和粘附、运动性(P0.05),且EOs组分的抗生物被膜与AHLs活性减少量正相关。香芹酚表现最强的抑菌和抑制生物被膜能力。2、香芹酚对四株荧光假单胞菌分离株表现相同的良好抑菌效果。比较香芹酚对两株荧光假单胞菌PFuk4和PF07野生株及LuxI缺失株(?LuxI)的生物被膜、胞外蛋白酶和AHLs信号分子的影响。结果显示,荧光假单胞菌?LuxI被膜和蛋白酶显著降低,而亚抑菌浓度香芹酚对?LuxI的抗被膜和抑制腐败能力也显著下降。在0.4 mM香芹酚作用下PFuk4和PF07野生株的生物被膜抑制率分别为35.8%和25.4%,而相应的?LuxI菌株抑制率仅为7.9%和21.8%,抑制效果显著下降(P0.05),激光扫描共聚焦显微镜(CLSM)也观察到香芹酚对野生株和?LuxI株被膜厚度抑制的差异。香芹酚对两野生株胞外蛋白酶的抑制率分别为15.6%和11.5%,而对突变株的抑制率仅为7.8%和7.6%。亚抑菌浓度香芹酚处理荧光假单胞菌后AHLs信号分子的种类和活性明显降低,PFuk4和PF07野生株中C-HSL分别减少68.8%和94.8%,而?LuxI中仅含微量的AHLs。采用docking分析发现,香芹酚能降低活化能及结合活性氨基酸,与C-HSL竞争性作用于LuxR蛋白,影响群体感应通路的调控。转录组学分析显示,香芹酚能影响多种生物被膜相关的基因,包括上调多糖代谢、pst系统和PhoB/U双组分系统相关的基因,从而干扰生物被膜的形成。同时,香芹酚显著下调菌体鞭毛合成、趋向性蛋白、氨基酸脱羧酶和蛋白酶等与运动和致腐的基因,还显著下调编码群体感应LuxR受体蛋白的基因。结果提示,香芹酚能作用于靶蛋白LuxR,干扰群体感应通路及其调控的生物被膜和致腐能力。3、探究荧光假单胞菌和金葡菌混合被膜的形成和对香芹酚的耐受性。结果表明,共培养环境中假单胞菌能抑制金葡菌,在TSB和鱼汁基质中均为优势的浮游菌和被膜菌。相对于单被膜,两种菌能形成更厚、更致密的成熟混合生物被膜和胞外分泌物。同时,香芹酚对金葡菌被膜菌比假单胞菌更敏感,混合被膜的两种菌都增强对香芹酚抑制的抵抗能力,0.4 mM香芹酚对假单胞菌和金葡菌单被膜抑制率为21.6%和41.8%,而对两种初始接种浓度(10:10和10:10)形成的混合被膜的抑制率则为13.4%和18.6%。CLSM和扫描电子显微镜(SEM)观察发现香芹酚能影响被膜结构,显著减少生物被膜厚度,增加被膜的异质性。并且,亚抑菌浓度香芹酚作用下单被膜胞外分泌物(EPS)基本消失,混合被膜的细菌聚集处仍见少量EPS。香芹酚对鱼汁中两菌单/混培养下蛋白酶活性、挥发性盐基氮(TVB-N)和溶血性都有显著地抑制(P0.05),但是共培养下对香芹酚抑制有抗性。两种菌共培养上清中AI-2活性高于单培养,而共培养AHLs分泌明显低于假单胞菌单培养。两种QS信号4,5-羟基-2,3-戊二酮(4,5-Dihydroxy-2,3-pentanedione,DPD,AI-2前体)和C-HSL体外添加发现,DPD能显著刺激混合被膜的形成(P0.05)。研