外泌体在慢性髓系白血病伊马替尼耐药中的作用及机制研究
作者单位：中国人民解放军空军军医大学
学位级别：硕士
导师姓名：刘利;杨国栋
授予年度：2019年
学科分类：1002[医学-临床医学] 100214[医学-肿瘤学] 10[医学]
摘 要：【背景】慢性髓系白血病(Chronic myelogenous leukemia,CML)是一种造血干细胞恶性克隆增殖性疾病。t(9;22)染色体畸变形成费城染色体及BCR-ABL融合基因是该疾病最可能病因。BCR-ABL基因所表达的融合蛋白具有持续活化的酪氨酸激酶活性,发挥促进增殖、抑制凋亡等功能。酪氨酸激酶抑制剂(Tyrosine kinase inhibitor,TKI),如伊马替尼(Imatinib,IM),可结合融合蛋白的ATP结合结构域,阻断酪氨酸激酶活性,阻止其向下游信号传递,阻断其功能发挥,对CML患者疗效显著。然而IM不能将CML治愈,耐药导致的疾病进展是CML患者死亡的最重要因素。耐药的原因有:***细胞对IM不敏感;***细胞BCR-ABL融合基因突变,导致融合蛋白构象改变,形成空间位阻,与IM亲和力下降;***-ABL基因扩增使BCR-ABL融合蛋白表达增多,原药物剂量相对不足;4.耐药相关蛋白如ABCG2等表达增多,排出胞内药物等。多种耐药机制均提示胞内药物浓度相对或绝对不足是耐药的主要特征,且为耐药发生的危险因素。因此探究CML细胞内IM药物浓度不足的发生机制及如何应对、逆转此现象,对改善CML耐药患者预后具有重要意义。外泌体(Exosome)是由内体膜内陷形成多囊泡体(Multiple vesicle body,MVB),进而与细胞膜融合后排出胞外的直径约30-150nm的脂质双分子层囊泡,能够携带多种胞内物质排出胞外,并参与远隔细胞间信息交流和物质运输等重要生物学功能。肿瘤细胞相比正常组织细胞分泌更多外泌体,在肿瘤发生、发展、耐药及转移等过程中发挥重要作用,然而外泌体分泌是否直接参与降低CML细胞内IM浓度并最终导致耐药尚有待研究。胆固醇是脂质双分子层的重要组成物质,其代谢异常可见于多种类型肿瘤,且在肿瘤耐药的发生中发挥重要作用。肿瘤细胞增多的胆固醇为其快速增殖提供了物质基础,同时也为外泌体分泌创造了有利条件。细胞膜褶皱处胆固醇含量多,且胆固醇含量增多时,内体倾向于形成多囊泡体,进而释放外泌体。相反,胆固醇含量减少会使内体倾向于与溶酶体融合而降解,外泌体分泌减少。因此,胆固醇代谢对外泌体的影响及在CML细胞耐药中的作用值得我们深入研究。【目的】通过对IM耐药的K562G细胞及对IM敏感的K562细胞胆固醇代谢及外泌体分泌的干预,探究胆固醇水平及外泌体分泌对细胞耐药的影响,并探讨胆固醇水平与外泌体分泌的相关性,从而明确胆固醇-外泌体-细胞耐药途径。【方法】1.培养K562细胞伊马替尼耐药株K562G;2.利用密度梯度离心方法提取外泌体、电镜拍摄观察细胞内MVB数量,BCA蛋白定量法测定K562及K562G细胞外泌体分泌数量的差异;使用药物GW4869及Rab27a基因干涉方法抑制外泌体分泌,并观察抑制外泌体分泌对细胞IM耐药性的影响;3.利用qRT-PCR检测K562及K562G细胞胆固醇代谢通路相关蛋白的表达,评估二者胆固醇代谢差异;使用阿托伐他汀、GW3965、甲基β环糊精、水溶性胆固醇处理细胞,利用胆固醇检测试剂盒及胆固醇染色-共聚焦显微镜检测方法检测胆固醇含量,观察干预胆固醇对细胞耐药性的影响;4.利用LC-MS(液相色谱串联质谱)方法测定细胞内及外泌体内IM含量,CCK-8测定两种细胞IC及流式细胞术检测凋亡等方法评估细胞耐药性。***-seq发现K562和K562G差异表达miRNAs,细胞转染候选miRNA mimics,观察其对ABCA1表达和外泌体分泌的影响。【结果】1.相同浓度IM处理K562和K562G两种细胞,K562G细胞凋亡率显著下降;经LC-MS测定,与K562细胞相比,K562G细胞内IM含量低。进一步研究发现,K562和K562G细胞均能分泌含有IM的外泌体;与敏感细胞K562相比,耐药细胞K562G分泌的外泌体数量显著增加,但单位外泌体内IM含量无统计学差异;表明K562G通过外泌体途径分泌更多IM。使用GW4869药物或干涉Rab27a基因抑制K562G细胞外泌体分泌,显著提高其对IM的敏感性。2.K562G细胞胆固醇合成相关酶表达水平低于K562细胞,而胆固醇吸收、排出及酯化相关蛋白表达增强,同时K562G胆固醇水平低于K562细胞。增加外源性胆固醇显著提高K562细胞耐药性,而使用阿托伐他汀、GW3965,甲基环糊精等3种方法降低胆固醇水平不能增强K562G对Imatinib的敏感性。3.K562G细胞与K562相比外泌体分泌增加、ABCA1表达显著增加、调控ABCA1表达的miR-106-5p表达降低。然而增加细胞内miR-106-5p抑制靶基因ABCA1表达后,外泌体分泌增加。【结论】1.外泌体分泌参与了细胞耐药的发生,抑制外泌体可部分
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