载脂蛋白A-I模拟肽L-4F调节骨髓源性抑制细胞和胰腺癌进展的作用研究

作     者：郭向东 

作者单位：天津医科大学 

学位级别：硕士

导师姓名：张荣信

授予年度：2019年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100214[医学-肿瘤学] 10[医学] 

主      题：L-4F 胰腺癌 髓系来源的抑制性细胞 STAT3 

摘      要：背景与目的L-4F是一种具有双亲性的载脂蛋白A-I(ApoA-I)模拟肽,由18个氨基酸组成,经过改造以模拟ApoA-I的抗炎和抗氧化功能。研究表明L-4F具有抑制肿瘤生长的作用,且通过下调肿瘤组织或免疫细胞中IL-17A,IFN-γ,IL-1β,IL-6的分泌,以及降低内毒素的作用途径来抑制炎症因子的分泌等发挥抗炎作用。胰腺癌作为癌症之王,在全球具有很高的致死率,同时具有很高的转移能力。在肿瘤发生发展的过程中,由于肿瘤细胞可以分泌大量的细胞因子到肿瘤微环境中,促进了髓系来源的抑制性细胞(MDSCs)等免疫细胞的免疫抑制功能,导致肿瘤对宿主的免疫应答产生耐受性,最终有助于肿瘤的进一步生长。在本研究中,从L-4F是否可以影响胰腺癌肿瘤中MDSCs的比例、增加小鼠脾脏和胰腺癌组织中CD4T和CD8T细胞的浸润,以及在体外环境中是否可以抑制MDSCs对T细胞的免疫抑制功能,增加T细胞增殖和分泌IFN-γ,降低MDSCs中ROS和HO的产生,并通过L-4F有效的下调PMN-MDSC中的p-STAT3信号通路等做了相关研究。方法本研究分为体内部分和体外部分。在体内研究中,我们首先培养小鼠胰腺癌细胞Panc02,并通过胰腺原位荷瘤的方法将细胞植入到C57BL/6小鼠胰腺中用来建立胰腺癌模型。从建模后的第三天开始,将荷瘤鼠随机分为两组,用腹腔注射的方法每天给小鼠注射Sc-4F(对照)或L-4F。治疗结束后处死小鼠并取其脾脏和肿瘤,通过直接测量肿瘤大小来评估L-4F对胰腺癌肿瘤的抑制程度。同时,分离小鼠脾脏和肿瘤中浸润的免疫细胞,用流式细胞技术检测并分析脾脏和肿瘤中MDSCs,CD4T以及CD8T细胞的比例,用来初步衡量L-4F对肿瘤发生发展过程中免疫微环境的影响。在体外研究中,我们首先从野生型C57BL/6小鼠的后肢腿骨中分离其骨髓细胞,并通过GM-CSF和IL-6进行体外定向诱导分化成MDSCs。通过MDSCs的极化、细胞凋亡和增殖实验检测L-4F对MDSCs是否有直接作用,利用Sc-4F(对照)或L-4F刺激MDSCs,以及利用经过Sc-4F(对照)或L-4F处理的MDSCs与小鼠正常脾脏细胞以共培养的方式,检测共培养后T细胞的增殖能力,评估L-4F处理后的MDSCs对T细胞增殖过程中免疫抑制作用的变化,同时通过流式细胞技术检测并分析了L-4F作用于MDSCs后对T细胞群体中CD4T和CD8T分化比例的影响。然后进一步检测了L-4F作用于MDSCs后对其活性氧(ROS)释放量的影响。最后我们用流式细胞技术检测了MDSCs经过L-4F体外处理后MDSCs细胞中STAT3磷酸化水平的变化。结果体内研究结果表明:1、荷瘤组小鼠经过L-4F治疗后,小鼠的肿瘤体积明显小于Sc-4F对照处理组;2、通过分离和检测小鼠脾脏和肿瘤中免疫细胞的浸润,发现与Sc-4F对照处理组相比,脾脏和肿瘤中单核细胞源性抑制性细胞(MO-MDSC)的比例没有明显的变化,而PMN-MDSC的比例均有明显的下降;3、通过分离和检测小鼠脾脏和肿瘤中免疫细胞的浸润,发现与Sc-4F对照处理组相比,L-4F处理组中脾脏中CD8T细胞的比例明显升高,而CD4T细胞的比例没有变化;与Sc-4F对照处理组相比,L-4F处理组中肿瘤组织中CD4T细胞和CD8T细胞的比例均明显升高;体外研究结果表明:1、我们发现与Sc-4F对照处理组相比,用L-4F处理的组中PMN-MDSC的数量显著降低。然而,MO-MDSC的比例没有明显的变化;2、与Sc-4F对照处理组相比,L-4F处理的MDSCs中,凋亡细胞的数量并没有发生明显的变化;同时,与未处理或低剂量处理的细胞相比,L-4F处理组MDSCs细胞的增殖能力也没有发生明显的变化;3、与Sc-4F对照处理组的细胞增殖能力相比,L-4F有效阻断了MDSCs对T细胞增殖的免疫抑制作用;T细胞与经过Sc-4F对照处理的MDSCs共培养后,显著降低了CD4T细胞和CD8T细胞的比例;当T细胞与经过L-4F处理的MDSCs共培养后,减轻了MDSCs对CD4T细胞和CD8T细胞增殖的抑制;4、与无MDSCs组相比,MDSCs可抑制Sc-4F对照处理组中T细胞分泌的IFN-γ,L-4F可以削弱这种免疫抑制功能;5、与Sc-4F对照治疗组相比,在L-4F处理组中,MDSCs释放的ROS和HO的量均显著降低;6、L-4F以剂量依赖的方式明显抑制了PMN-MDSC中STAT3的磷酸化水平。结论根据以上结果可以得出,L-4F短肽对小鼠胰腺癌具有抑制作用。同时可以降低小鼠脾脏和肿瘤中PMN-MDSC细胞的比例,并可以促进脾脏和肿瘤中CD8T细胞的浸润,另外促进肿瘤中CD4T细胞的浸润。因此,L-4F可能通过抑制免疫抑制和激活免疫免疫应答的双重作用来实现抑制肿瘤的目的。此外