基于SNP-KASP技术对啤酒花品种鉴定与纯度检测的研究

作     者：蒋培基 

作者单位：四川农业大学 

学位级别：硕士

导师姓名：蒲彪;王德良

授予年度：2018年

学科分类：0832[工学-食品科学与工程（可授工学、农学学位）] 08[工学] 0836[工学-生物工程] 082203[工学-发酵工程] 0822[工学-轻工技术与工程] 083203[工学-农产品加工及贮藏工程] 

主      题：啤酒花 单核苷酸多态性 竞争性等位基因特异性PCR 品种鉴定 纯度检测 

摘      要：啤酒花是啤酒酿造的基本原料之一,在啤酒中起着发泡与防腐的作用,是啤酒中苦味物质的主要来源,被称为“啤酒之魂。目前,市售啤酒花品种繁多,存在一定的以次充好现象。这不仅影响了啤酒花产业的健康发展,也对啤酒酿造企业带来较大的负面效应。更重要的是这种行为可能影响消费者的身体健康,带来食品安全隐患。然而,目前啤酒花国标检测仅仅涉及到4个理化指标,并不包含啤酒花纯度和真实性检测。因此,开发出一套准确、快速、低成本可用于市售啤酒花纯度和真实性检测的方法势在必行。本研究旨在开发出一套可应用于啤酒花品种鉴定的技术手段,使啤酒企业能对酿酒原料的质量进行有效的把控,对啤酒花原料供应商提供一定的监督手段,为啤酒酿造企业产品质量的稳定和啤酒花产业的健康发展保驾护航。本文以国内啤酒酿造企业使用量较大的18种啤酒花为原料,基于单核苷酸多态性（Single Nucleotide Polymorphisms,SNP）分子标记,利用竞争性等位基因特异性PCR（Kompetitive Allele Specific PCR,KASP）基因分型检测技术对啤酒花进行品种鉴定与纯度的检测。首先,提取啤酒花基因组DNA。然后,通过选取国内外常用的8种啤酒花进行高通量测序与生物信息学分析寻找并初步筛选出可用于啤酒花品种鉴定的SNP位点。进而以18个啤酒花品种的DNA为模板,通过聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction,PCR）扩增与一代测序,对SNP位点进行验证,筛选出可区分18个啤酒花品种的SNP位点,最后基于筛选出的SNP位点和KASP基因分型检测技术对预混样品和对企业样品开展了基因型的定性与定量分析,完成了预混样品的检测以及企业样品的品种鉴定与纯度检测,试验该技术的可行性与准确性。结果如下:（1）使用QIGEN试剂盒对啤酒花基因组DNA提取。结果表明,提取的基因组DNA片段15KP,基因组完整。浓度在215 ng/μL以上,满足实验要求。对8个品种啤酒花基因组高通量测序和生物信息学分析后共得到46003个较为可靠的SNP位点。通过进一步的筛选,确定了2636个可用于品种鉴定分析的SNP位点。（2）经真实性验证与进一步筛选,最终得到11个SNP位点,通过这些稳点可以区分18个啤酒花品种,统计得到了18个啤酒花品种的SNP数据表,建立了区分路线图。（3）利用11个SNP位点对预混样品进行了检测,结果表明:H01、H02、H03、H04、H06、H09、H10、H11八个位点的基因型检测结果完全符合预期。H05、H07、H08三个位点与样品混杂率在5%以上的样品检测时与预混样基因型判定结果一致,而在混杂度为2%的样品中基因型检测结果出现了偏差。表明该方法可以满足对混杂比例大于5%的样品进行准确的区分。此外,由于KASP的两种荧光信号值比与混杂样品比例之间存在极显著线性相关,不同混杂样品混杂比例可以作为标准曲线对啤酒花进行纯度的检测。最后,利用该技术对企业送来的青岛大花样品与Sazz样品检测发现,青岛大花样品纯度95%,而Sazz啤酒花为混杂样品。通过标准曲线法测定Sazz啤酒花的纯度只有65.75%。与企业信息对比（青岛大花纯度98%,Sazz啤酒花纯度为70%）检测误差5%。以上结果表明,SNP-KASP技术能有效的对啤酒花样品进行品种鉴定与纯度检测。