Orexin-A对肠缺血再灌注大鼠肠功能损伤的保护作用及潜在机制研究

作     者：荆保华 

作者单位：青岛大学 

学位级别：硕士

导师姓名：徐珞

授予年度：2019年

学科分类：1001[医学-基础医学(可授医学、理学学位)] 100104[医学-病理学与病理生理学] 10[医学] 

主      题：Orexin-A 缺血再灌注损伤 M3受体 氧自由基 大鼠 

摘      要：目的:肠缺血再灌注(ischemia-reperfusion,I/R)损伤常可发生在出血性休克、小肠移植及严重外伤等过程中,可引起小肠收缩力降低、微血管通透性升高以及肠黏膜屏障功能下降,进而可导致多脏器功能衰竭。食欲素(Orexins)是一种脑肠肽,主要分布于下丘脑,但其受体广泛分布于中枢及外周组织,包括胃肠道系统的各个部分,如肌间神经丛、粘膜下神经丛、胃肠道黏膜以及平滑肌等。Orexins主要参与摄食、能量平衡、心血管功能以及应激等功能调控。但关于orexins在肠缺血再灌注损伤中的作用,尤其是对肠缺血之后对肠运动功能和肠神经系统保护作用尚未见报道。本课题通过构建肠缺血再灌注模型,探讨在肠缺血再灌注之前给予orexin-A静脉灌注对肠收缩活性、摄食及肠神经元的保护作用及潜在机制。方法:选用雄性Wistar大鼠,制备大鼠空肠平滑肌条,分别给予10M、10M、10M orexin-A,观察不同浓度orexin-A对空肠肌条收缩的影响;预先分别以SB-334867、一氧化氮合酶神经元型(nNOS)、选择性抑制剂N’-硝基-L-精氨酸(L-NNA)、M受体阻断剂阿托品、或Na通道阻滞剂河豚毒素(TTX)预先孵育空肠肌条,观察orexin-A促肌条收缩效应的影响,分析该效应潜在机制。采用夹闭肠系膜上动脉45min再灌注90min建立肠缺血再灌注大鼠模型;通过肠缺血再灌注前尾静脉微量注射泵注射orexin-A(500 pmol/Kg/min)30min,观察orexin-A对离体大鼠空肠平滑肌条收缩活动的影响;采用肠缺血再灌注前尾静脉灌注orexin-A 30min,观察I/R大鼠术后小肠推进率和摄食变化;通过荧光免疫组化或TUNEL等研究方法,观察orexin-A预处理对I/R大鼠肠粘膜上皮细胞形态学、凋亡、以及肠肌间神经丛神经元表达的影响;采用Western blot、Elisa等方法,检测空肠组织凋亡相关蛋白(Bcl-2、Bax以及Caspase-3)和过氧化或炎性反应相关因子(丙二醛、谷胱甘肽和髓过氧化物酶)的改变。结果:在正常大鼠,Orexin-A剂量依赖性促进空肠肌条收缩(P0.05.01),SB-334867预先孵育,可完全阻断orexin-A促肌条收缩效应(P0.05)。若预先以L-NNA(P0.05)、阿托品(P0.05)或TTX(P0.05)孵育肌条,orexin-A促肌条收缩作用可被部分抑制。在肠I/R模型大鼠,空肠平滑肌条收缩频率显著降低(P0.05),收缩曲线下面积显著减少(P0.05),若给予乙酰胆碱(Ach)刺激,其最大收缩张力明显降低(P0.05);若肠缺血再灌注前尾静脉灌注orexin-A 30min,可明显改善上述肌条收缩减弱现象(P0.05.01)。与假手术组相比,肠I/R大鼠术后1-7天24h累计摄食量明显减少(P0.05.01),术后第5天检测的小肠碳末推进率也显著降低(P0.01);若肠缺血再灌注前采用orexin-A尾静脉灌注,与注射NS对照组相比,I/R大鼠术后第3天始摄食量明显增加(P0.05),小肠碳末推进率也显著增加(P0.05)。HE染色结果显示,肠I/R大鼠肠绒毛剥脱,有大量炎性细胞浸润,毛细血管扩张充血;若大鼠经orexin-A预处理,空肠黏膜上皮细胞损伤减轻,有较少炎性细胞浸润。神经元特异性烯醇化酶(NSE)荧光免疫组化染色结果显示,与NS+假手术组比较,缺血再灌注组(NS+I/R)大鼠NSE免疫阳性神经元数明显减少(P0.05),若经Orexin-A预先处理(orexin-A+I/R),大鼠NSE免疫阳性神经元数明显升高(P0.05)。乙酰胆碱转移酶(ChAT)荧光免疫组化研究显示,镜下ChAT免疫阳性神经元与其神经纤维交错。与NS+假手术组相比,NS+I/R组大鼠肌间神经丛ChAT免疫阳性面积(P0.05)及IOD值均明显降低(P0.05);而Orexin-A干预组(orexin-A+I/R)与NS+I/R组相比,ChAT免疫阳性神经面积(P0.05)及IOD值均明显增加(P0.05)。Western blot结果显示,与假手术大鼠相比,肠I/R大鼠空肠胆碱能受体3(M3)和Bcl-2表达均显著降低(P0.05),而Bax和CasPase-3表达量显著升高(P0.05);若肠缺血再灌注前采用orexin-A尾静脉灌注,可使大鼠空肠组织M3和Bcl-2表达显著回升(P0.05),Bax和Caspase-3表达回降(P0.05)。ELISA研究结果显示,与NS+假手术组相比,NS+I/R组大鼠空肠组织MDA(P0.05)和MPO(P0.05)含量显著升高,GSH含量显著降低(P0.05);与NS+I/R组相比,Orexin-A+I/R大鼠空肠MDA和MPO含量显著降低(P0.05),GSH含量显著升高(P0.05)。结论:Orexin-A可剂量依赖性促进小肠肌条收缩,该效应可能是通过orexin-1受体(OX-1R)通路实现的,且NOS、Na离子通道、以及M受体信号通路可能也参与了该过程调控;Orexin-A外周给药可通过改善肠缺血再灌注损伤诱导的肠氧自由基增加、中性粒细胞活化、肠上皮细胞凋亡以及肌间神经丛兴奋性运动神经元减少等,进而促进小肠蠕动,增加大鼠摄食,有利于促进大鼠康复。