OsPIR1参与水稻抗稻瘟病与盐胁迫下sRNA生物合成的研究

作     者：张秀妍 

作者单位：内蒙古农业大学 

学位级别：硕士

导师姓名：张笑宇;王磊;徐妙云

授予年度：2019年

学科分类：09[农学] 0904[农学-植物保护] 090401[农学-植物病理学] 090402[农学-农业昆虫与害虫防治] 

主      题：水稻 OsPIR1 稻瘟病 RNAi sRNAs 盐胁迫 

摘      要：水稻是全球最重要的粮食作物之一,自发芽至收获,水稻在生长过程中不仅要抵抗非生物胁迫的影响,还要抵抗各种病害所带来的影响,例如稻瘟病。由稻瘟病菌所引起的稻瘟病每年都在全世界范围造成水稻生产的重大损失,选育抗病品种是防治该病害最有效的方法之一。实验室前期在田间繁种过程中发现低表达或敲除OsPIRIN1(OsPIR1)基因的水稻材料出现对田间病害抗性增强的表型。本试验以日本晴背景的野生型水稻材料(WT)、OsPIR1基因敲除突变体材料(CRISPR/Cas9,以下简称为pir1)、OsPIR1基因沉默材料(OsPIR1-RNAi)以及OsPIR1基因过表达材料(OsPIR1-OE)为研究对象,对OsPIR1基因参与水稻稻瘟病和盐胁迫的抗性功能方面进行研究,得到的主要研究结果如下:1.通过对萌发5 d的WT、pir1和OE幼苗根部进行RNA-seq分析,发现敲除OsPIR1基因可显著影响水稻体内6个植物-病原体互作相关基因的表达,其中编码OsPR1a与SPL胞外蛋白的基因表达量上调,编码OsCML10、OsCML15、NBS-LRR抗病蛋白的基因表达量下调。而过表达OsPIR1基因可显著下调水稻体内8个植物-病原体互作相关基因的表达,分别编码NBS-LRR抗病蛋白、LRR受体/OsFLS2、OsCML15、OsPR1a、OsCML24、CAMK。说明OsPIR1参与了水稻抗稻瘟病的生物学过程。2.低表达或敲除OsPIR1基因的水稻材料表现出对稻瘟菌生理小种Guy-11抗性增强的表型,且发病率与病情指数较野生型有所降低。3.低表达或敲除OsPIR1基因的水稻材料对稻瘟菌的侵入更为敏感。病原菌入侵10 d内,二者体内POD、SOD、CAT和脯氨酸总含量均高于野生型和过表达材料。4.以OsPIR1基因沉默材料为研究对象,在盐胁迫条件下对水稻miRNA的表达谱以及hpRNA的加工特征进行了研究,结果表明水稻体内能够与OsPIR1基因反义链高度匹配的siRNAs数量随处理时间的增加而降低。推测水稻体内基因沉默效率随处理时间的延长而逐步降低。5.处理前后,水稻体内首位碱基为U和A以及长度为21～22 nt的siRNAs占主要部分。推测水稻Argonaute(AGO)蛋白家族中OsAGO1a/b/c与OsAG05c与水稻DCL(Dicer-like)蛋白家族中DCL2与DCL4发挥了主要作用。6.水稻体内共检测到248个已知的miRNA,来源于132个不同的家族,除此之外,共预测到了 59个新的miRNA。7.水稻根、茎、叶中分别有31、11、9个差异表达miRNA,分属于29个家族靶向592个功能基因,且差异miRNA的靶基因主要为涉及到各种生理代谢进程的转录因子,如SPZ、GRF、SAP、HD-ZIP、NF-YA、Laccase等。新发现的miRNA共预测到754个靶基因,主要为涉及到各种生理代谢进程的酶类,如UDP-葡糖基转移酶、DNA聚合酶、蛋白磷酸酶、氧化还原酶、水解酶、锌指蛋白等以及一些未知蛋白。8.进一步功能研究发现,差异表达的miRNA所对应的靶基因,在细胞组分中显著富集于膜相关细胞器;在分子功能中显著富集于核糖核苷酸结合、ATP结合等过程;在生物学过程中,靶基因显著富集于含氧酸代谢、磷代谢、氮代谢等过程。新预测的miRNA所对应的靶基因在细胞组分中显著富集于细胞、细胞核等部位;在分子功能中显著富集于核糖核苷酸结合、ATP结合等过程;在生物学过程中,靶基因显著富集于细胞代谢、RNA代谢等过程。***分析结果显示,盐胁迫后Osa-miR166h、Osa-miR166k上调表达,Osa-miR169h、Osa-miR530下调表达,针对Osa-miR169h的4个靶基因进一步定量检测,其中的3个靶基因上调表达,这与Osa-miR169h的下调表达结果相一致。综上,本文初步探索OsPIR1基因在水稻-稻瘟病互作过程中的调节作用,以及盐胁迫处理不同时间时OsPIR1-RNAi植株体内miRNA的表达谱以及siRNA的加工机制,以期为水稻的抗性育种提供理论依据,也为探索基因沉默技术在植物体内的加工机制添上一笔。