细叶百合LpWRKY20基因的克隆及其对烟草的遗传转化

作     者：杨柳慧 

作者单位：东北林业大学 

学位级别：硕士

导师姓名：周蕴薇

授予年度：2019年

学科分类：0710[理学-生物学] 090706[农学-园林植物与观赏园艺] 0907[农学-林学] 07[理学] 09[农学] 071007[理学-遗传学] 0901[农学-作物学] 090102[农学-作物遗传育种] 

主      题：细叶百合 WRKY转录因子 克隆 烟草转化 抗旱 

摘      要：细叶百合(Lilium pumilum 花下垂、花被片反卷、花朵娇艳。是一种重要的观赏性花卉,是百合抗性育种的重要亲本。本研究从细叶百合转录组中筛选出WRKY转录因子家族,分析该家族在休眠解除过程中的表达情况;从中选取对休眠解除具有调控作用的基因,分析其对非生物胁迫的响应;克隆该基因并对其进行生物信息学分析;构建植物表达载体转化到烟草中;对转基因植株进行干旱胁迫,通过对干旱胁迫下的表型观察及生理指标测定,明确该基因是否具有抗旱功能。本文主要研究结果如下:1.通过分析细叶百合休眠解除转录组中的WRKY转录因子家族,从中共分离出了40个WRKY转录因子,其中GroupⅠ共有6个基因、GroupII共有28个基因、GroupⅢ有6个基因。随着休眠解除LpWRKY20基因的相对表达量逐渐升高,证明其参与了休眠解除的过程。2.在休眠过程中往往伴随着非生物的胁迫,荧光定量分析表明在不同的非生物胁迫中LpWRKY20表达量存在差异且在不同的组织器官中表达模式也不相同。干旱胁迫下LpWRKY20在鳞茎中出现了明显的上调表达,推测基因对干旱的响应较为敏感。3.该基因开放阅读框(ORF)为1899bp,预测编码632个氨基酸。保守结构域分析显示,LpWRKY具有两个高度保守的WRKY结构域属于GroupⅠ组基因。生物信息学分析显示蛋白相对分子量为68.36kDa,理论等电点为5.45,为亲水性蛋白,不含信号肽且没有跨膜结构;亚细胞定位预测显示该基因在细胞核中表达;蛋白二级结构主要以“mixed型蛋白存在。4.用双酶切法构建pBI121-LpWRKY20-GFP植物表达载体,经农杆菌介导叶盘法将其转入烟草中并获得抗性植株。利用基因枪法将融合表达载体和pBI121-GFP植物表达载体轰入洋葱表皮细胞进行亚细胞定位分析,结果显示融合表达载体只在细胞核中表达。5.转基因植株在干旱胁迫中的SOD活性、CAT活性均高于对照,且随着时间的延长这种清除体内自由基的能力在显著升高,而MDA含量均低于对照,说明转基因植株细胞膜受损程度较低,其具有较强的自我修复能力。干旱条件下生理指标的变化反应了转基因植株抗性要强于对照,初步推断LpWRK具有抗旱的功能。