硫酸铍致16HBE细胞炎症反应及其对microRNA表达谱的影响

作     者：易珊 

作者单位：南华大学 

学位级别：硕士

导师姓名：张朝晖

授予年度：2019年

学科分类：100405[医学-卫生毒理学] 1004[医学-公共卫生与预防医学(可授医学、理学学位)] 10[医学] 

主      题：16HBE细胞 硫酸铍 miR-663b 炎症反应 LIF 

摘      要：目的:探讨硫酸铍(Beryllium sulfate,BeSO4)致人支气管上皮细胞(16HBE)的炎症反应及其对micro RNA表达谱的影响。方法:1.以16HBE细胞为研究对象,用不同浓度BeSO4(0、100、150、200、250、300μmol/L)处理细胞48 h,采用MTT法检测其对16HBE细胞活力的影响,分别使用酶联免疫吸附实验(ELISA)、免疫印迹试验(Western Blot)检测16HBE细胞内白细胞介素-10(Interleukin-10,IL-10)、肿瘤坏死因子-α(Tumor Necrosis Factor-alpha,TNF-α)、干扰素-γ(Interferon-γ,IFN-γ)、环氧化酶-2(Cyclooxygenase-2,COX-2)及诱导型一氧化氮合酶(inducible Nitric Oxide Synthase,i NOS)的表达。2.采用small RNA测序技术检测BeSO4处理后16HBE细胞内miRNA的表达,并按|log2Fold Change|1和P0.05的标准,筛选差异表达较大的miRNAs。使用Target Scan、miRanda和Pita数据库对部分miRNAs进行靶基因预测,利用DAVID在线工具对靶基因进行Gene Ontology(GO)分析和the Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes(KEGG)pathway富集分析,运用Cytoscape软件构建靶基因的调控网络,使用实时荧光定量PCR(q RT-PCR)验证候选miRNAs的表达。3.选择目标miRNA进行功能分析,构建miRNA mimics、miRNA inhibitor,利用脂质体转染技术处理16HBE细胞,随后用BeSO4处理,分别采用ELISA、Western Blot法检测IL-10、TNF-α、IFN-γ、COX-2及i NOS的表达,探讨增加或减少miRNA在BeSO4诱导16HBE细胞炎症反应中的作用。使用miRanda、Target Scan、DIANA Tools和miRwalk数据库对目标miRNA进行靶基因预测,并与m RNA测序结果(课题组前期转录组测序结果)取交集,绘制韦恩图,采用Target Scan预测miR-663b和靶基因LIF的结合位点。结果:1.与对照组相比,BeSO4抑制16HBE细胞的活力,且存在剂量反应关系,差异具有统计学意义(P0.05),BeSO4对16HBE细胞的半数抑制浓度(IC50)为260μmol/L;BeSO4可致16HBE细胞内IL-10、TNF-α、IFN-γ、COX-2及i NOS等炎症相关因子表达增加(P0.05)。*** RNA测序:与对照组相比,BeSO4处理组16HBE细胞中有179个差异表达的miRNAs,其中上调的有88个、下调的有91个。这些差异表达的miRNAs中已命名有93个、未命名有86个。3.符合差异表达筛选标准的miRNAs有28个,包括18个上调的miRNAs和10个下调的miRNAs。对28个miRNAs进行靶基因预测发现,23个miRNAs预测的共同靶基因转录本有27160(基因5140)个,其余5个miRNAs没有预测到共同的靶基因。预测得到的靶基因主要位于细胞质和细胞核中,与转录、信号转导、蛋白结合等生物学作用有关。q RT-PCR验证结果表明miR-1306-5p、miR-193b-5p、miR-4485-3p和miR-877-5p表达上调,miR-23b-5p和miR-663b表达下调,与测序结果一致。4.与对照组相比,miR-663b mimics明显下调16HBE细胞内IL-10、TNF-α、IFN-γ、COX-2及i NOS等炎症相关因子的表达(P0.05),减轻BeSO4对16HBE细胞的炎症反应,而miR-663b inhibitor则增加了16HBE细胞内IL-10、TNF-α、IFN-γ、COX-2及i NOS等炎症相关因子的表达(P0.05)。5.预测到miR-663b的靶基因共有271个,与m RNA测序结果有交集的有65个。通过软件分析miR-663b与LIF的3’UTR存在结合位点,LIF是miR-663b的潜在靶基因。而基因LIF主要参与JAK-STAT信号通路。结论:***4可致16HBE细胞产生炎症反应。***4可致16HBE细胞内88个miRNAs表达上调,91个miRNAs表达下调。***-663b的潜在靶基因是LIF。miR-663b过表达可减轻BeSO4致16HBE细胞的炎症反应;而miR-663b的下调则加重BeSO4致16HBE细胞的炎症反应。