低氧诱导外泌体通过HIF-1α和miR-650环路促进胰腺癌细胞侵袭与转移

作     者：叶增 

作者单位：华中科技大学 

学位级别：硕士

导师姓名：王春友

授予年度：2019年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100214[医学-肿瘤学] 10[医学] 

主      题：胰腺癌 低氧 外泌体 miR-650 侵袭 迁移 

摘      要：研究目的本研究探索低氧胰腺癌细胞外泌体对常氧胰腺癌细胞侵袭与转移的影响,并进一步研究外泌体miRNA在这过程中发挥的作用。旨在为胰腺癌的综合治疗提供新的策略。研究方法提取低氧胰腺癌细胞培养基中的外泌体,并与常氧胰腺癌细胞孵育,观察后者侵袭、转移效应。再通过miRNA芯片和实时荧光定量PCR检测miRNAs在低氧及常氧胰腺癌外泌体中的表达差异,选择上调最明显的miRNA(miR-650)。通过CHIP、荧光素酶报告基因等实验探究低氧促进miR-650表达机制。在低氧胰腺癌细胞中抑制miR-650后,再提取外泌体,做生物学效应实验,如transwell和划痕实验来观察抑制miR-650后低氧胰腺癌细胞所分泌的外泌体对正常氧含量条件下胰腺癌细胞侵袭、转移能力的影响。在常氧细胞过表达miR-650,观察其外泌体对胰腺癌细胞侵袭、转移的影响。通过检测常氧细胞的HIF-1α及其下游靶标的表达情况,检测低氧外泌体是否影响常氧胰腺癌细胞低氧相关的信号通路。最后通过网站预测,找出miR-650的下游靶标VHL mRNA,并通过PCR、双荧光素酶报告基因及western blot验证。同时过表达miR-650和VHL,实验观察HIF-1α变化情况。研究结果胰腺癌细胞的功能学效应研究表明,低氧胰腺癌细胞外泌体明显促进常氧胰腺癌细胞的侵袭与转移。miRNA芯片及PCR结果显示,miR-650在低氧胰腺癌细胞外泌体中升高最明显。CHIP和荧光素酶报告基因等实验结果表明HIF-1α促进miR-650转录。抑制miR-650后,低氧胰腺癌细胞外泌体的促侵袭和转移能力亦明显减弱。而在常氧细胞过表达miR-650后,其外泌体也有促侵袭和转移能力。Western Blot结果显示,低氧胰腺癌外泌体和miR-650促进HIF-1α及其侵袭转移相关下游ZEB1的表达,抑制下游E-cadherin的表达。表明低氧胰腺癌外泌体向常氧胰腺癌细胞传递了低氧信号。通过TargetScan网站预测,发现VHL是mi R-650的下游靶标。PCR、双荧光素酶报告基因及western blot证明过表达miR-650在RNA水平和蛋白水平降低VHL。此外,过表达VHL可以大部分逆转mi R-650诱导的HIF-1α升高。研究结论低氧在转录水平促进miR-650的表达,通过包装进入外泌体,传递给常氧胰腺癌细胞,激活后者低氧信号通路,促进其侵袭与转移。在miR-650与HIF-1α之间存在一个正反馈环路,相互促进。通过靶向抑制外泌体miR-650来抑制胰腺癌的侵袭与转移可能为胰腺癌综合治疗提供一个潜在方向,但尚需进一步证实。