光质处理苋菜幼苗转录组分析及MYB转录因子功能研究

作     者：彭丽云 

作者单位：福建农林大学 

学位级别：硕士

导师姓名：刘生财;赖钟雄

授予年度：2019年

学科分类：09[农学] 0902[农学-园艺学] 090202[农学-蔬菜学] 

主      题：苋菜 转录组分析 甜菜色素 类黄酮 MYB 功能分析 

摘      要：苋菜(Amaranthus tricolor L.)属于石竹目苋科苋属一年或多年生草本植物,含有大量的甜菜色素和类黄酮,具有降血压、抗氧化和抗癌等作用,具有广泛的应用价值。甜菜色素代谢调控机制还不清楚,需要深入探究。本研究对蓝光和黑暗处理的苋菜胚轴进行了转录组测序,筛选出甜菜色素代谢相关差异基因,并对苋菜转录组中R2R3-MYB转录因子进行筛选分析;探讨了不同光质处理对苋菜种子萌发过程以及幼苗生长过程的影响,同时测定了甜菜色素和类黄酮代谢相关基因表达;研究了不同温度和激素处理对苋菜幼苗甜菜色素和类黄酮代谢相关基因表达及生物酶活性的影响;初步验证了苋菜AmMYB1和AmMYB2功能。1蓝光和黑暗处理的苋菜胚轴转录组测序分析利用RNA-Seq技术对蓝光和黑暗处理的苋菜胚轴进行了转录组测序,测序结果显示,有94 993个Unigene得到功能注释;转录因子(TF)预测发现MYB及MYB-related数量最多,说明在苋菜响应光胁迫过程中,MYB可能对甜菜色素代谢有重要的调控作用;在19 798个差异表达基因中筛选获得了37个差异表达的MYB,21个甜菜色素代谢相关基因,19个类黄酮代谢相关的基因。2苋菜转录组R2R3-MYB分析对‘全红’和‘大红’苋菜转录组中R2R3-MYB转录因子进行了筛选和分析。结果显示,在两个转录组中,共筛选出72条R2R3-MYB,其蛋白N端的保守基序为[W]-x(20)-[W]-x(21)-[W]-x(16)-[E]-x(15)-[W]-x(18)-[W],其中R2结构域的保守氨基酸位点多于R3保守结构域;苋菜AmMYB1、AmMYB2、AmMYB61可能与甜菜色素的代谢有密切的关系;对苋菜和拟南芥R2R3-MYB的密码子分析结果显示,两者的密码子都偏好以A、T结尾,且苋菜R2R3-MYB的密码子偏好性大于拟南芥。3光质处理对苋菜甜菜色素代谢相关基因表达及相关酶活性的影响3.1光质处理对苋菜种子萌发过程及甜菜色素代谢相关基因表达的影响定量结果表明:不同的光质对苋菜种子萌发速率无明显影响;在种子萌发过程中甜菜色素代谢相关的糖基转移酶基因AmB6-GT、AmDOPA5-GT表达水平较高;AmCYP76AD1在白光、蓝光、红光中处理的苋菜胚轴期、子叶期、幼苗期呈上调趋势,以蓝光、白光较为明显,在绿光和黑暗中呈下调趋势。在萌发阶段AmMYB1、AmB5-GT、AmDODA、AmTyDC、AmPPO1等与甜菜色素代谢相关的基因表达水平较低。3.2光质对苋菜幼苗甜菜色素及类黄酮代谢的影响试验结果表明:光能促进‘全红’苋菜甜菜色素和类黄酮的积累,但不同光的促进程度不同,积累量由高到低依次为白光、蓝光、红光、绿光,黑暗条件不利于甜菜色素积累;在单色光源中,蓝光对甜菜色素和类黄酮积累的促进作用最显著;AmMYB1、AmCYP76AD1对苋菜甜菜色素的合成具有重要的调节作用;AmDODA、AmPPO1在红光中表达量较高;PAL酶的活性与下苋菜类黄酮的积累量呈正相关关系,与类黄酮代谢相关的基因AmCHS、AmF3H表达与苋菜中类黄酮的积累密切相关;绿光处理下‘全红’苋菜CAT、SOD、POD活性较高;黑暗处理下‘全红’苋菜PAL、CAT活性较低,POD活性最高。3.3光质转换对苋菜幼苗甜菜色素代谢相关基因表达的影响将不同光质处理5 d的苋菜幼苗进行光质转换处理,结果表明苋菜幼苗能够快速适应新的光处理环境,生长状态和色素积累会趋于新的光处理;定量结果显示白光和蓝光处理下AmMYB1、AmCYP76AD1、AmDODA表达量较高,蓝光、红光、绿光中转入黑暗中后AmPPO1表达量较高;试验表明AmMYB1、AmCYP76AD1、AmDODA在甜菜色素代谢中发挥重要作用,与甜菜色素代谢有密切的关系,黑暗处理对AmPPO1表达的影响较大。4温度与激素处理对苋菜甜菜色素和类黄酮代谢相关基因表达及相关酶活性的影响对苋菜幼苗进行了不同温度及一定浓度的SA、MJ、ABA处理,结果显示,在45℃高温条件下,苋菜甜菜色素代谢相关的基因表达量与对照25℃相比,变化不明显,且苋菜中TYR、PAL、CAT、POD、SOD的活性呈下降的趋势。35℃条件下,AmMYB1、AmCYP76AD1、AmDODA的表达量相对较低,其表达量与15℃条件下呈现相反的变化趋势,类黄酮代谢相关的基因PAL、CHS、CHI、F3H的表达量也低于15℃处理。激素处理结果显示,一定浓度SA、ABA的短暂处理促进甜菜色素和类黄酮代谢相关基因的表达;MJ能够促进甜菜色素代谢相关基因的表达,但是却抑制苋菜中类黄酮代谢相关基因的表达;SA、MJ处理24 h时,POD活性升高达到显著水平;在ABA处理12 h时,TYR、PAL、POD活性较高,处理48 h时CAT活性显著升高。5苋菜AmMYB1、AmMYB2的功能分析为了研究AmMYB1、AmMYB2在苋菜甜菜色素代谢中的作用,本研究将构建好的AmMYB1-1301-35S、AmMYB2-1301-35S重组质粒转入农杆菌中,将含有目的基因的农杆菌菌液通过注射法转入烟草进行瞬时表达,使用浸花法转入拟南芥中进行异源表达,发现AmMYB1、AmMYB2能够在这两种植物中高水平表达,但不会引起颜色变化,进一步揭示AmMYB1、AmMYB2可能是苋菜中甜菜色素代谢的正调控因子,且不参与花青素合成。