抗Cyclin D1胞内抗体抑制乳腺癌细胞增殖的分子机制

作     者：王凤兰 

作者单位：吉林大学 

学位级别：硕士

导师姓名：李桂英

授予年度：2019年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100214[医学-肿瘤学] 10[医学] 

主      题：乳腺癌 Cyclin D1 胞内抗体 PRDX4 GRP78 

摘      要：乳腺癌已成为全球女性癌症死亡的主要原因之一,严重威胁女性的生命健康。尽管目前临床治疗有了很大改善,但是仍然存在着乳腺癌患者术后易复发、转移及耐药等许多亟待解决的问题。因此探究新型乳腺癌治疗策略并深入探讨其机制的研究具有重要意义。Cyclin D1是细胞周期进程中G1期到S期转换的限速因子,在乳腺癌等多种肿瘤中存在过表达,已成为乳腺癌等肿瘤靶向治疗的重要靶点。实验室前期成功制备了具有较好体内外抑制乳腺癌细胞增殖的内质网滞留型抗Cyclin D1胞内抗体ER-ADκ,但分子机制尚不清楚。前期实验室对抗Cyclin D1胞内抗体表达的乳腺癌细胞与对照细胞进行差异蛋白质组学分析,鉴定了包括PRDX4(Peroxiredoxin 4)和GRP78(Glucose-regulated protein 78)在内的多个差异蛋白点。已有研究显示,PRDX4是ROS(reactive oxygen species)的降解酶,PRDX4的下调会显著提高ROS水平,引起细胞氧化应激,促进细胞凋亡。ROS依赖性内质网应激会提高GRP78的蛋白水平,促进细胞凋亡。为了明确ER-ADκ对PRDX4和GRP78的影响,深入探究抗Cyclin D1胞内抗体在抑制乳腺癌细胞增殖调控中的作用机制,本研究通过Western blot、实时荧光定量PCR、ROS检测、GST pull down等一系列实验分析,取得如下结果:(1)通过Western blot和实时荧光定量PCR实验,检测抗Cyclin D1胞内抗体ER-ADκ在MCF-7细胞的表达对PRDX4的影响,结果显示,ER-ADκ下调MCF-7细胞中PRDX4的蛋白水平,并且ER-ADκ抑制PRDX4的mRNA表达。(2)抗Cyclin D1胞内抗体ER-ADκ在MCF-7细胞的表达对ROS水平及内质网应激的影响实验结果显示,ER-ADκ显著提高MCF-7细胞中ROS水平,提高内质网应激的标志性分子GRP78的mRNA表达水平并且上调GRP78的蛋白水平。(3)通过STRING网站预测GRP78和PRDX4可能存在相互作用,接下来通过间接免疫荧光实验、免疫共沉淀实验及GST Pull down实验分析二者相互作用。间接免疫荧光实验结果表明,在MCF-7细胞中PRDX4与GRP78存在共定位。免疫共沉淀实验结果表明,MCF-7细胞中PRDX4与GRP78存在相互作用。成功表达和纯化了可溶性GST-PRDX4和GST蛋白,对MCF-7细胞蛋白进行GST pull down分析结果表明,PRDX4与MCF-7细胞内GRP78存在相互作用。(4)通过实时荧光定量PCR实验检测胞内抗体ER-ADκ对MCF-7细胞内PRDX4和GRP78下游相关因子转录水平的影响,结果表明,ER-ADκ显著上调CHOP,Caspase-3,p21,Beclin 1和Atg 4的mRNA水平,下调RAD51的mRNA水平。上述研究结果表明,ER-ADκ可能通过抑制PRDX4表达,导致ROS不能正常清除,进而引发内质网应激,GRP78上调,诱导乳腺癌细胞凋亡。本研究为阐释抗Cyclin D1胞内抗体抑制乳腺癌细胞增殖的分子机制提供实验依据,为抗Cyclin D1胞内抗体治疗乳腺癌奠定了基础。